新一代全基因组人源化小鼠构建技术：TurboKnockout^®

目录

• 导语：复杂基因修饰模型如何兼顾准确性与构建效率
• 一、TurboKnockout®基因敲除技术
• 二、TurboKnockout®技术优势
• 三、TurboKnockout®基因编辑小鼠模型
• 四、相关人源化小鼠推荐
• FAQ

新一代全基因组人源化小鼠构建技术：TurboKnockout®

导语：复杂基因修饰模型如何兼顾准确性与构建效率

在全基因组人源化、大片段敲入、复杂条件性等模型构建中，研究团队不仅关注修饰是否准确，也需要综合评估建系周期、遗传稳定性、验证路径和后续繁育效率。基于ES细胞打靶体系的基因编辑动物模型定制可为复杂基因修饰提供更稳定的技术路线，而TurboKnockout®进一步通过建系与Neo自删除策略压缩传统流程。

建立在传统基因打靶技术之上的TurboKnockout®基因编辑技术，不仅具有传统ES打靶技术成熟、修饰准确、效果稳定等优点，更是使得传统ES打靶技术减少两代繁育时间，周期快至4个月，是大片段基因修饰等复杂模型的首选构建方式。

一、TurboKnockout®基因敲除：跨越“嵌合体”阶段且自删除Neo

基于ES打靶技术的TurboKnockout®技术采用了独特的建系和基因改造技术，建立了具有高效遗传优势的TurboKnockout®ES细胞系，通过特定胚胎发育阶段的显微注射，使TurboKnockout®ES细胞100%代替内源ES细胞，从而实现跨越“嵌合体”阶段，把ES打靶构建周期缩短至快至4个月。且TurboKnockout®采用独特的Self-deleting Neo Cassette，所获得的TurboKnockout®小鼠与任何品系小鼠交配，都可以100%自删除Neo。即TurboKnockout®不仅实现跨越“嵌合体”阶段，还能真正自删除Neo，从而快速获得去除Neo的杂合子小鼠。

图1. TurboKnockout®基因打靶、ES细胞筛选、胚胎注射及小鼠交付流程示意图

二、TurboKnockout®技术优势

• 独立自主知识产权：TurboKnockout®技术无专利纠纷困扰，是涉及新药研发项目的常用技术。
• 可进行大片段基因编辑：可胜任复杂的基因修饰，实现Mb级敲入及敲除，单次最大可敲入350 kb的序列，ES细胞可耐受至多7轮打靶仍具有生殖系遗传，如构建全基因组人源化小鼠和人源化抗体小鼠。
• 无脱靶效应：TurboKnockout®技术建立在传统ES打靶技术之上，没有脱靶效应，可通过PCR、染色体核型、Southern blot检测，流式细胞术、RT-qPCR、WB等方式在细胞阶段进行项目表达检测，基因修饰准确、效果稳定。
• 周期更短：实现跨越“嵌合体”阶段且自删除Neo，减少两代繁育时间，构建周期快至4个月；同时，TurboKnockout®可在ES水平做多步BAC重组，进一步缩短服务周期。
• 批量获得纯合子模型：优化的纯合ES克隆筛选系统结合囊胚前注射或四倍体补偿技术，可5个月批量获得纯合基因编辑小鼠。
• 品系选择灵活：赛业生物可提供C57BL/6NCya、C57BL/6JCya、BALB/cAnCya、129S2/SvPasCya等多品系选择。

图2. TurboKnockout®技术优势概览

三、TurboKnockout®基因编辑小鼠模型

TurboKnockout®技术可用于全基因组人源化模型、全人源抗体小鼠、完全性基因敲除小鼠、条件性基因敲除小鼠、基因敲入小鼠及KO-First模型等多类复杂基因修饰项目。

HUGO-GT®全基因组人源化模型

HUGO-GT®全基因组人源化模型（Humanized Genomic Ortholog for Gene Therapy）依托自主研发的TurboKnockout®技术，可将包含启动子、外显子、内含子及关键UTR非编码区的完整人类基因功能序列精准原位替换小鼠基因组同源位点，单基因替换长度最高近500 kb，能高度还原人类基因真实调控网络，具备极强临床相关性。

该模型已覆盖神经肌肉、心血管代谢、肿瘤、免疫、眼科、减重增肌、血脑屏障、罕见病、in vivo CAR-T等多领域，是ASO、siRNA、基因编辑、单抗、ADC、in vivo CAR-T等各类前沿药物开展药效验证、致病机制研究与安全性评估的优质体内工具。此外，我们还可提供肿瘤、神经、眼科、代谢和自免等多领域模型和药效评价全流程服务，全面赋能新药研发。

HUGO-Ab®全人源抗体小鼠

HUGO-Ab®全人源抗体小鼠系列产品包含HUGO-Mab全人单克隆抗体小鼠、HUGO-Light全人共轻链抗体小鼠和HUGO-Nano纳米抗体小鼠，拥有丰富的抗体序列多样性，包含全部的人源抗体重链、Kappa和Lambda轻链可变区germline基因。三个功能差异化的系列，精准解决抗体开发中“成药性不足、轻重链错配、IgG抗体穿透力弱”三大核心痛点，形成覆盖单抗、双抗、纳米抗体的全链条研发工具矩阵。其卓越的性能在抗体发现过程中展现出良好的效果，得到多家跨国药企、生物制药公司和学术机构的认可，为治疗性抗体新药提供了高效的研发引擎。

完全性基因敲除小鼠

完全性基因敲除小鼠是通过基因敲除技术，把目的基因的所有外显子、几个重要外显子或功能区域敲除，获得全身所有组织和细胞中均不表达该基因的小鼠模型，主要用于研究某个基因对全身生理病理功能的影响。

图3. 完全性基因敲除小鼠的等位基因设计示意图

完全性基因敲除小鼠建系原则与流程

1. 去除抗性基因Neo：选择阳性TurboKnockout®小鼠与野生型小鼠杂交，获得去除打靶载体中Neo基因的F1代杂合子KO（+/-）。
2. 获得纯合子：再挑选一对F1代杂合子KO小鼠进行自交，通过PCR鉴定筛选得到去除Neo的纯合子KO小鼠（-/-）。

图4. 完全性基因敲除小鼠建系繁育流程

条件性基因敲除小鼠

条件性基因敲除小鼠通过把两个LoxP位点插入目的基因一个或几个重要外显子的两端，制备含两个LoxP位点的TurboKnockout®-flox小鼠。TurboKnockout®-flox小鼠在与表达Cre重组酶的小鼠杂交之前，目的基因表达完全正常；与组织特异性表达Cre酶的小鼠杂交后，可在特定组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞中表达正常。

该模型主要用于具有胚胎致死性目的基因的研究，以及研究基因在特定组织或细胞中的生理病理功能；与控制Cre表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因的表达同时实现在时间和空间两方面的调控。

图5. 条件性基因敲除小鼠的等位基因设计与Cre重组示意图

条件性基因敲除小鼠建系原则与流程

1. 与Cre小鼠杂交：TurboKnockout®-flox小鼠与组织特异性的Cre小鼠杂交，获得去除Neo抗性且单条染色体有缺失的阳性F1代组织特异性cKO杂合子小鼠（+/-）。
2. 获得纯合子：挑选一对F1代小鼠进行自交，通过PCR鉴定筛选得到组织特异性去除基因的F2代cKO纯合子小鼠（-/-）。

图6. 条件性基因敲除小鼠建系繁育流程

基因敲入小鼠

基因敲入小鼠可以在目的基因位置引入特定突变或外源基因。例如在目的基因上引入点突变，或将报告基因如EGFP、mRFP、mCherry、mYFP或LacZ等通过同源重组方式引入目的基因的特定位点，从而通过报告基因跟踪目标基因的表达。也可以用报告基因取代小鼠本身的基因，使KO/KI同时发生，主要用于药物筛选、信号通路和示踪相关研究。

图7. 基因敲入小鼠的等位基因设计示意图

基因敲入小鼠建系原则与流程

1. 去除抗性基因Neo：选择阳性TurboKnockout®KI小鼠与野生型小鼠杂交，获得去除打靶载体中Neo基因的杂合子F1代小鼠。
2. 获得纯合子：再挑选一对杂合子F1代小鼠进行自交，通过PCR鉴定筛选得到去除Neo的F2代纯合子KI小鼠。

图8. 基因敲入小鼠建系繁育流程

KO-First技术制作基因敲除小鼠

KO-First技术通过在内含子中插入一个两边带有FRT位点的基因破坏盒实现敲除，该破坏盒含有Splice acceptor、报告基因和Neo。除此之外，在目的基因敲除外显子的两侧各插入一个LoxP位点。因此得到的小鼠是目的基因敲除同时敲入报告基因与抗性基因的小鼠。通过灵活选择Flp/FRT重组系统和Cre/LoxP重组系统，可达到同时获得完全性敲除和条件性敲除的实验目的。该小鼠与Flp小鼠交配时，可还原已敲除基因的表达，获得条件性基因敲除小鼠；在此基础上与Cre小鼠交配，又可获得目的基因敲除小鼠。

图9. KO-First等位基因设计及Flp/Cre重组策略示意图

四、相关人源化小鼠推荐

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FAQ：TurboKnockout®基因编辑小鼠常见问题