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iPS细胞技术服务
赛业生物iPS细胞一站式体外技术服务平台，拥有成熟的重编程、基因编辑和体外分化技术，同时结合一站式表型分析服务，可为客户打造多种疾病应用场景的体外模型构建和检测服务。
iPS细胞技术服务研究思路
iPS细胞技术服务内容
| 类型 | 项目 | 交付标准 | 质量控制QC | 项目周期 | 订购 |
|---|---|---|---|---|---|
| 重编程 | iPSC 重编程技术服务 |
|
| 12周起 | |
| 基因编辑细胞系（iPSC） | 基因敲除 |
|
| 8周起 | |
| 定点突变 | 12周起 | ||||
| 基因敲入 | 12周起 | ||||
| 稳转细胞系（iPSC） | 干扰稳转株 |
|
| 9周起 | |
| 过表达稳转株 | 8周起 | ||||
| 定向分化 | 运动神经元分化 |
|
| 6周起 | |
| CD34+分化 |
|
| 3周起 | ||
| NPC神经祖细胞分化 |
|
| 2周起 | ||
| RPE分化 |
|
| 5周起 | ||
| 肝类器官分化 |
|
| 8周起 |
* 额外检测服务根据客户需求：可提供核型、脱靶、流式、WB、luciferase、增殖、凋亡、周期、迁移/侵袭等。
iPS细胞技术服务优势
重编程
难点：
早期的方法依赖逆转录病毒和慢病毒载体等，但可能存在病毒基因组整合导致转基因被重新激活的风险。
解决方案：
采用非整合方式进行重编程，以此转录和表达多能干细胞基因，产生非整合的人iPS细胞，该方法的安全系数高于使用病毒载体。
细胞培养
难点：
培养条件苛刻，编辑过程容易分化，失去干性。
解决方案：
18年干细胞培养经验，拥有成熟的iPSC编辑和培养体系。通过赛业生物的培养体系，我们可培养出理想的iPSC集落：内部紧实、大小均匀且边缘清晰。
iPSC基因编辑
难点：
不同个体和组织来源的iPSC差异较大，基因操作难度高。
解决方案：
成熟稳定的基因编辑平台，拥有上万例基因编辑项目经验，iPSC项目成功经验丰富。
- 智能的Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统：可科学设计高效率、低脱靶的gRNA。
- 自研的α-donor载体HDR系统：HDR效率高达50%，远高于市面上的编辑效率，可实现无痕修复（footprint-free）。
- 合适的转染条件：通过优化转染条件，转染效率>50%，活率高达80%。
- RNP递送体系：选择RNP递送提升gRNA切割效率和转染细胞活率，降低脱靶效率，KO效率高达90%。
单克隆形成
难点：
单克隆化制备复杂，克隆形成率较低。
解决方案：
具备独特的单细胞筛选技术，单克隆形成率可达30%以上，通过筛选一轮即可获得足够的阳性克隆。
定向分化
难点：
不同来源iPSC细胞系之间存在分化能力和增殖速率的差异性。
解决方案：
通过优先选择与分化细胞类型更适配的iPSC，且在培养基和添加剂层面进行优化，大大提升其特异性和分化效率，有效降低未成熟或未分化的细胞比率。
iPS细胞技术服务案例
1. iPSC重编程
细胞形态
核型检测
STR分型检测
细胞特异性标志物
流式检测
体外三胚层分化
畸胎瘤验证
2. iPSC基因编辑
通过基因编辑技术，在诱导性多能干细胞iPSC中的AAVS1位点敲入EGFP 基因。如下图所示，通过RNP法将sgRNA和Donor转染到iPSC中，经过HDR途径将EGFP序列插入AAVS1位点。
图1. 敲入方案设计
注：引物设计策略为扩增整个EGFP及其所在基因组上下游的部分序列。无插入EGFP的带型为762bp，成功插入EGFP的带型为3194bp处。结果显示，4个单克隆在3194bp处出现条带，说明克隆成功插入EGFP，且为纯合克隆。
PCR凝胶电泳验证数据
图2. iPS-EGFP KI琼脂糖凝胶电泳鉴定结果
注：引物设计策略为扩增整个EGFP及其所在基因组上下游的部分序列。无插入EGFP的带型为762bp，成功插入EGFP的带型为3194bp处。结果显示，4个单克隆在3194bp处出现条带，说明克隆成功插入EGFP，且为纯合克隆。
测序验证数据
图3. iPSC-EGFP KI测序结果
纯合单克隆荧光验证
EGFP在IPSC纯合克隆中100%表达
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图4. iPSC-EGFP KI纯合克隆荧光图片
核型分析数据验证
细胞培养后经G显带进行染色体核型分析，显示染色体数为46数目正常，染色体结构无明显异常。
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图5. iPSC-EGFP KI核型分析
免疫荧光-干性检测
通过免疫荧光染色，检测NANOG、OCT4和SOX2三个干性标记基因，均能检测出阳性信号，表明该敲入细胞具有干性
图6. iPSC-EGFP免疫荧光-干性检测
3. iPSC定向分化
神经干细胞（NPC）分化——神经疾病及药物模型
运动神经元（MN）分化——ALS等神经疾病及药物模型
造血干细胞（CD34+）分化——可用于血液谱系细胞分化如NK、T细胞等
