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基因敲除小鼠
基因敲除小鼠是指通过基因工程的方法使小鼠体内某种或全部基因功能缺失的小鼠模型，通常包括完全性基因敲除（KO）小鼠和条件性基因敲除（CKO）小鼠。赛业生物可采用TurboKnockout®基因打靶技术和CRISPR-Pro基因编辑技术制作基因敲除小鼠。
如何选择基因敲除与条件性敲除小鼠？
| 完全性基因敲除小鼠 | 条件性基因敲除小鼠 | |
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应用 |
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优势 |
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劣势 |
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完全性基因敲除小鼠
完全性基因敲除（Knockout，KO）小鼠，也叫全身性基因敲除小鼠，是通过基因敲除技术，把需要敲除目的基因的所有外显子或几个重要的外显子或者功能区域敲除掉，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。
TurboKnockout®完全性基因敲除小鼠
TurboKnockout®完全性基因敲除小鼠是通过TurboKnockout®技术把需要敲除目的基因的所有外显子或几个重要的外显子或功能区域敲除掉，使得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因。建立在传统基因打靶技术之上的TurboKnockout®基因编辑技术，不仅具有传统ES打靶技术成熟、修饰准确、效果稳定等优点，更是使得传统ES打靶技术减少两代繁育时间，周期快至4个月，是大片段基因修饰等复杂模型的首选构建方式。
TurboKnockout®完全性基因敲除小鼠的建系原则与流程：
- 1.去除抗性基因Neo：选择阳性TurboKnockout®小鼠与野⽣型小鼠杂交，自删除Neo，获得去除打靶载体中的Neo基因的F1代杂合子KO（+/-）小鼠。
- 2.再挑选⼀对F1代杂合子KO小鼠（+/-）进行自交，通过PCR鉴定筛选得到基因敲除的F2纯合子KO小鼠（-/-）。
CRISPR-Pro完全性基因敲除小鼠
CRISPR-Pro完全性基因敲除小鼠主要采用靶基因设计和构建gRNA与Cas表达质粒，造成目的基因的功能区域被敲除，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。CRISPR-Pro技术沿用核酸酶介导的基因修饰技术体系，采用独特的受精卵处理方式使受精卵偏好同源重组修复路径，进而提高同源重组效率，制作周期快至3个月。
CRISPR-Pro完全性基因敲除小鼠的建系原则与流程：
- 1.通过针对一个或多个靶基因或靶基因不同位点设计、构建相应的gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas蛋白和mRNA⼀起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代阳性小鼠。
- 2.F0代阳性小鼠与野⽣型小鼠进行交配，获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子小鼠。
- 3.选择来自同⼀只F0代小鼠，基因型⼀致的F1代杂合小鼠，达到性成熟后互配，可获得F2代小鼠。对获得的F2代小鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代小鼠中25%为纯合子，50%为杂合子，25%为野生小鼠。
条件性基因敲除小鼠
条件性基因敲除（Conditional Knockout，CKO）小鼠，又叫组织特异性敲除小鼠，是通过染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP和基因编辑技术，实现在特定的组织或细胞中基因敲除，而在其它组织或细胞中该基因表达正常的小鼠模型。与完全性敲除小鼠相比，条件性敲除小鼠可以避免基因胚胎致死的问题，还可以实现基因在特异组织或者特定时间的表达，是精准研究靶基因功能的重要工具。
TurboKnockout®条件性基因敲除小鼠
TurboKnockout®条件性基因敲除是通过把两个LoxP位点插入到目的基因的⼀个或几个重要外显子的两端以制备出有两个loxP位点的TurboKnockout®-flox小鼠，TurboKnockout®-flox小鼠在与表达Cre重组酶小鼠杂交之前，目的基因表达完全正常；而当TurboKnockout®-flox小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进⾏杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其它组织或细胞表达正常。TurboKnockout®条件性基因敲除小鼠制作周期快至4个月。
TurboKnockout®条件性基因敲除小鼠建系原则与流程：
- 1.与Cre小鼠杂交：TurboKnockout-flox小鼠与组织特异性的Cre小鼠杂交，获得去除Neo抗性且单条染色体有缺失的阳性F1组织特异性flox杂合子小鼠（flox/-）。
- 2.挑选⼀对F1代小鼠（flox/-）进⾏自交，通过PCR鉴定筛选得到组织特异性敲除基因的F2代flox纯合子小鼠（-/-）。
CRISPR-Pro条件性基因敲除小鼠
CRISPR-Pro条件性基因敲除是通过把两个LoxP位点插入到目的基因的⼀个或几个重要外显子的两端以制备出flox小鼠，该flox小鼠在与表达Cre重组酶小鼠杂交之前，该基因表达正常；当flox小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可实现在特定的组织或细胞中敲除该基因，⽽在其它组织或细胞中该基因表达正常。CRISPR-Pro条件性基因敲除小鼠制作周期一般为快至3个月。
CRISPR-Pro条件性基因敲除小鼠建系原则与流程：
- 1.将F0代flox小鼠（Founder）与野生型小鼠（WT）进行交配，于子代中筛选flox杂合小鼠（flox/+）。
- 2.将F1代flox杂合小鼠进行自交，理论上可获得25%的纯合flox小鼠（flox/flox），50%的杂合flox小鼠（flox/+），25%的野生型小鼠（+/+）。
- 3.将flox小鼠（flox/flox或flox/+）与Cre工具鼠互配，可获得携带Cre的flox杂合小鼠（flox/+，Cre）。
- 4.将携带Cre的flox杂合小鼠（flox/+，Cre）与flox小鼠（flox/flox或flox/+）回交⼀代，即可筛选到组织特异性敲除纯合小鼠（flox/flox，Cre）。
备注
- 诱导型的Cre工具鼠，需要加药后才能实现特异组织删除。
- 有生殖细胞泄露风险的Cre工具鼠，繁殖时按照建议性别选择不同基因型小鼠。
- F1代若有剩余的flox杂合小鼠（flox/+），或想要加快获得目标小鼠，第2步可以用flox/+直接配Cre工具鼠，可缩短⼀代周期。
基因敲除小鼠服务案例文献精选
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