敲除细胞基因与RNA干扰的区别｜四种基因功能研究策略

功能减弱与功能缺失的程度需要实际检测，不能只凭方法名称判断。
基础表达、细胞存活及下游检测终点都会影响方法选择。
过表达与敲入应围绕表达调控、示踪定位等具体目的设计。
技术选择不保证获得显著表型，需结合编辑、表达和功能证据。

基因功能研究有哪些基础策略？

刚进实验室的小萌新，总有一种天下风云出我辈的风范，两耳不闻窗外事，一心只想发CNS。

想要实验快速上手，首先要掌握的就是研究策略。

在基因功能研究中常用两种基础策略，功能减弱或缺失，功能增强或获得。

RNA干扰：从RNA层面降低表达

实现基因功能减弱，可以采用RNA干扰（RNAi）技术下调目的基因表达。在RNAi使用中，siRNA或shRNA的设计是关键。长度约为21bp的siRNA与蛋白形成RISC复合物，结合目的基因的mRNA，从而使其降解，达到降低基因表达水平的目的（注意RNAi是作用于mRNA水平）。但需要引起注意的是，如果目的基因在细胞中本体表达就较低的情况下（一般ΔCT＞16），就不适合用RNAi了。

这里讨论的是利用RNAi降低目标表达的研究策略。ΔCT的解释依赖内参、检测方法及实验条件，不能将单一阈值作为所有体系是否适用RNAi的通用判据；应结合实际表达和干扰结果判断。

敲除细胞基因：从基因组层面研究功能缺失

随着CRISPR/Cas技术的成熟，越来越多的科研人员采用基因敲除的方式实现基因彻底缺失的目的。与RNAi不同的是，基因敲除理论上可作用于基因组上所有的基因片段，并使目的基因的蛋白完全不表达，从而更有利于观察细胞表型的变化，简单来说，就是更容易做出实验结果。

基因敲除后蛋白一定完全不表达吗？

不一定。已有细胞研究发现，部分编辑模型仍存在残余蛋白表达或功能。因此，目标位点编辑不等于自动获得完全功能缺失，解释表型前需要检查实际结果。[1] “更容易做出实验结果”也不能理解为成功或显著表型的保证。

基因敲除和RNA干扰如何选择？

CRISPR/Cas基因敲除和RNAi干扰表达，哪种调控方式更好？

没有更好，只有最适合！

1. 两种方法没有绝对的好坏，通常RNAi技术由于操作简便，使用广泛，但CRISPR/Cas可使基因功能丧失更彻底，因此近些年受到广泛追捧。

2. 某些情况下不适合用RNAi，例如需要改变无法转录的DNA区域，只能用基因敲除。

3. 某些特殊情况，敲除该基因会导致细胞生长缓慢，停滞甚至死亡，这样获得基因敲除细胞株比较困难，因此就需要选择通过RNA干扰的手段实现功能减弱。

RNAi不能直接改变目标DNA序列；若研究目标是改变DNA区域，应选择符合具体目的的基因组编辑策略，而非将“只能用敲除”推广到所有DNA研究。若敲除导致细胞难以存活，RNA干扰可作为本文讨论的功能减弱思路，但也需评价其实际效果。

敲除与敲低所得表型不一定一致。特定模型中已有突变诱导遗传补偿的研究，说明不能把某一方法的结果直接视为另一方法必然得到的结果，也不能将该现象泛化为所有细胞的固定规律。[2]

过表达和基因敲入如何选择？

对于基因功能增强或获得来说，常用的就是过表达和基因敲入了。

过表达和基因敲入，如何选择？

上调表达使得功能增强通常采用的方法是将目的基因的编码区（CDS）构建到载体中，导入细胞内使目的基因的表达量显著增加。但基因在细胞内本体表达已经很高时，此时再进行过表达的调控，细胞的表型很可能不会发生变化，此外，外源高表达对细胞也是个刺激压力，会产生假阳性和假阴性的结果。

而对于功能获得，则常采用基因敲入的方法，例如引入标记基因序列，便于目的基因的示踪和定位，或引入调控表达元件如增强子，调控目的基因的表达；但由于受到同源重组效率和插入基因片段大小的影响，目前细胞基因敲入存在较高的技术难度，普通实验室难以开展。

功能增强、功能获得与具体技术并非一一对应。过表达是否产生可解释表型、敲入是否满足示踪或调控目的，应按实际构建与检测结果判断；敲入难度受细胞、位点、插入片段和验证要求影响，不能仅按“普通实验室”作固定能力判断。

四种基因调控方法对比

方法	主要作用层面	本文对应目的	选择重点
RNA干扰	RNA	功能减弱	基础表达、干扰程度与细胞状态
基因敲除	基因组DNA	功能缺失	编辑结果、残余蛋白及实际功能
过表达	增加目标表达	功能增强	表达水平、定位与非生理表达影响
基因敲入	基因组特定位点	引入标签或调控元件	预期插入结果与下游研究需求

选择方案与功能验证

掌握了研究策略要进行细胞水平功能性验证，貌似很简单。但开展实验后发现好像并不是那么回事。即便按照流程仔细做，实验数据也跟闹着玩似的，一次一个样，数据五花八门，说起来都是泪。

实验虐我千百遍，问题太多该找谁？

今天，我们要为进入科研领域的你，送上一颗定心丸。从此打怪升级，发CNS不在话下。

选择基因调控方案前需要确认什么？

先明确是降低表达、研究功能缺失、增强表达，还是插入标签或元件；再核对细胞背景、基础表达及细胞存活需求，最后确定与研究目的对应的鉴定和功能终点。原文“发CNS”属于科普表达，不代表技术服务可保证论文或实验结果。

可围绕基因敲除细胞系、过表达干扰细胞系或基因敲入细胞系选择研究入口，结合体外检测沟通验证需求。更多资料见技术指南中心。

参考文献

[1] Smits AH, et al. Biological plasticity rescues target activity in CRISPR knock outs. Nature Methods. 2019;16:1087–1093. doi:10.1038/s41592-019-0614-5.

[2] Rossi A, et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 2015;524:230–233. doi:10.1038/nature14580.

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iCyagen可辅助检索基因、模型及文献资料，研究设计仍需核对原始证据并结合实验验证。

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FAQ：基因功能研究方法选择

敲除细胞基因与降低基因表达是一回事吗？

不是。本文中的基因敲除改变基因组序列，RNA干扰则主要降低目标RNA水平；实际功能变化均需验证。

基因敲除和RNA干扰哪种更好？

没有脱离研究目的的固定优劣。应结合需要的功能干预程度、细胞存活与验证终点判断。

敲除后细胞死亡怎么办？

本文提出可考虑RNA干扰实现功能减弱，但仍需评价具体细胞的耐受性与实际干扰效果。

基因表达很低就一定不能用RNAi吗？

不能仅用一个ΔCT阈值决定。应结合检测背景、实际表达和干扰结果判断。

过表达没有表型能说明基因没有作用吗？

不能直接下结论，需要核对表达调控是否达到预期以及检测终点是否适合研究问题。

过表达和基因敲入有什么区别？

本文过表达主要用于提高目标表达；敲入用于在基因组引入标签或调控元件等特定序列，选择取决于研究目的。

敲除细胞基因还是RNA干扰？一文理清四种基因功能研究策略

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