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条件性基因敲除小鼠鉴定要区分携带基因型、目标组织重组与敲除效果。flox或Cre阳性不能单独证明目标组织已完成有效删除[1]。
- 普通PCR条带大小判读不能覆盖所有点突变。
- 转基因阳性、合子状态与拷贝数是不同问题。
- ES模型的筛选元件状态需结合具体构建资料。
- 基因型、目标位点重组与表达/功能证据需要分别理解。
小鼠基因型PCR鉴定能回答什么问题？
基因工程小鼠基因型PCR鉴定的基本原则是利用基因工程小鼠基因组与野生型小鼠基因组的序列差异，以小鼠基因组DNA为模板进行PCR，并以凝胶电泳对比不同基因型特异产物的大小，根据条带大小来区分小鼠的不同基因型。今天我们来学习CRISPR/Cas点突变小鼠、转基因鼠以及ES打靶技术构建鼠的鉴定。
原文从点突变、转基因与ES打靶三类情况介绍鉴定。其PCR概述对应能通过产物差异判读的设计，不表示任何序列差异都能直接在常规凝胶中分辨。下文保留原案例，并说明条件性模型的额外证据层次。
点突变小鼠为什么不能只看常规条带？
下述“只用PCR无法鉴定”限定普通扩增后只比较常规电泳片段大小的情境，不排除针对具体变异设计的等位基因特异性等方法。单碱基替换通常不改变长度；少量插入缺失是否可分辨则取决于变化大小与检测方式。
点突变由于只是单碱基或少数碱基的增加、缺失或替换，在电泳图上突变片段与野生型条带的大小是无法区分的。因此只用PCR是无法鉴定的，还需要结合测序或者酶切来鉴定。
点突变鉴定的引物与酶切思路
选择在发生点突变的上下游片段设计引物，设计引物时，还要考虑一下突变后是否有酶切位点，使酶切点两边的片段大小有区分。先进行PCR扩增，再将扩增产物电泳后切胶或者测序。若是突变的点之后的序列正好是某种酶特异识别的位点，还可以用酶切实验进行验证，酶切成功则发生点突变的片段被切为两段，野生型的不会被酶识别切割。若没有引入酶切位点的，就只能通过将PCR产物测序，然后通过峰图分析目的碱基是否有突变。
上述酶切示例以突变引入可识别位点为前提；也可能存在其他酶切模式，因此不能把“突变切为两段、野生型不切”作为所有突变的统一规则。“没有酶切位点就只能测序”在本文中用于介绍所列方法，不是对全部可用技术的排除。
如何理解预期片段与原文结果图？
使用F/R扩增，条带1的大小为野生及阳性的条带，切胶回收送测。
“条带1”是原图示例中的标识，不能据此为其他品系补写统一片段长度。相同大小的扩增产物不代表目标碱基序列相同，需要匹配原设计与后续序列证据。
转基因阳性、拷贝数与纯合状态有何区别？
本节针对原文所述插入位点与拷贝数未知的转基因筛查场景。“只能判断阳性”指普通阳性筛查提供的信息范围，不意味着所有转基因模型均无法确定插入位点、拷贝数或合子状态[2]。
转基因鼠由于技术的局限性，存在拷贝数和插入位点不确定的问题，只能判断阳性。一般设计3对以上的引物，若同时鉴定为阳性则判断为阳性鼠。繁殖过程中，建议不同line的F0与WT分别传代，再通过表达量的验证筛选出最佳传代的line。
“3对以上引物”保留原设计思路，不作为每个品系必须采用的固定判定标准。多处阳性也不自动证明整个插入结构完整或表达符合预期。F0及不同line应按各自构建与传代记录理解，阳性、表达与遗传稳定性需要分别评价。
ES打靶小鼠应结合哪些设计信息？
使用ES技术构建的鼠，鉴定方法与设计原理与CRISPR/Cas的相似。ES技术利用了Neo筛选，赛业的TurboKnockout技术可以获得自删该元件的F1代小鼠，不需要再对Neo进行验证。
本段“自删Neo”及“不需要再验证”限定于所述构建及已经确认筛选元件状态的情境，不能推广至所有ES打靶模型或以F1代数代替状态证据。具体等位基因、筛选元件及交付鉴定资料仍需核对。
条件性基因敲除小鼠如何分层验证？
条件性基因敲除需要把携带flox/Cre与目标组织中的重组区分。尾或耳等常规分型样本不一定代表目标组织状态，常规flox分型方案也未必能识别删除后的等位基因[1]。
| 验证层次 | 主要问题 | 不能直接推出的结论 |
|---|---|---|
| 携带基因型 | 是否携带目标flox等位基因与Cre元件 | 不代表目标组织已发生预期重组 |
| 目标位点重组 | 所测组织中是否出现预期删除事件 | 不代表所有目标细胞均已完全删除 |
| 表达与功能 | 目标转录本、蛋白或相关功能是否符合研究问题 | 不能单凭一个基因型条带确定 |
混合组织包含不同细胞，残余未重组信号应结合组织组成解释。目标转录本或蛋白证据需要匹配等位基因设计，不能简单把某个结果转换为统一的敲除效率[1]。
不同鉴定结果如何解释？
| 常见结果 | 可支持的信息 | 需要另行区分 |
|---|---|---|
| 点突变样本条带大小相同 | 得到相近大小的扩增产物 | 目标碱基是否改变 |
| 转基因PCR阳性 | 检出相应目标序列 | 拷贝数、合子状态及表达 |
| flox阳性且Cre阳性 | 携带所测遗传元件 | 目标位点重组与功能删除 |
| Neo状态说明 | 对应特定构建记录 | 不能仅按ES技术或F1名称推定 |
鉴定方案应先明确研究问题。本文不提供所有品系通用的引物、片段长度或反应参数，也不把PCR筛查直接视为完整模型功能验证。
模型与验证相关资源
设计与模型需求可了解基因敲除小鼠定制、基因敲入小鼠定制、转基因小鼠定制及Cre工具鼠。进一步研究可结合表型分析与自然繁育沟通；具体基因分型或重组验证项目范围按实际服务确认。
原理阅读可参考条件性基因敲除小鼠原理与Cre-loxP系统应用，更多资料见技术指南中心。
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参考资料
[1] The Jackson Laboratory. 4 essential steps to verify your Cre-lox model. https://www.jax.org/news-and-insights/jax-blog/2014/april/four-essential-steps-to-verify-your-cre-lox-model
[2] The Jackson Laboratory. Genotyping FAQ. https://www.jax.org/jax-mice-and-services/customer-support/technical-support/genotyping-faq
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iCyagen可辅助检索模型与文献资料。具体基因型、等位基因结构与验证结果仍需依据品系和原始实验资料判断。
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FAQ：条件性基因敲除小鼠鉴定
flox阳性是否代表条件性敲除成功？
不能。flox阳性说明携带所测等位基因，目标组织是否重组及表达/功能是否符合预期需要另外判断。
Cre阳性是否代表目标组织已重组？
不能仅据Cre基因型作此结论。重组应对应目标组织、目标位点及具体模型条件。
点突变与野生型条带相同，应如何理解？
相同大小不代表序列相同。普通电泳长度判读与目标碱基鉴定是不同问题。
转基因阳性是否等于纯合？
不等于。阳性、拷贝数与合子状态分别需要相应证据，不能凭普通阳性条带直接互换。
普通PCR能直接判断转基因拷贝数吗？
普通终点阳性筛查不能直接等同拷贝数测定，具体检测需匹配模型与相应方法。
ES打靶模型都不需要检查Neo吗？
不能这样概括。原文描述特定TurboKnockout构建的元件自删除特点，其他模型及状态应按实际构建资料确认。
为什么基因型、目标组织重组与表达要分别判断？
三者回答不同问题。组织中细胞组成及等位基因设计也影响结果解释，单个条带不能覆盖全部证据层次。
