如何用TurboKnockout技术高效攻克复杂基因编辑难题？

在生命科学与医学研究中，基因编辑小鼠模型无疑是探索基因功能、模拟人类疾病、验证药物靶点的基石。从依赖胚胎干细胞（ES细胞）的同源重组技术，到革新性的CRISPR-Cas9系统，技术浪潮一次次推动着科研边界的拓展。

 

然而，当面对条件性敲除等复杂精细的基因修饰需求时，这些常见的基因编辑技术各具特点也各有局限：选择传统的ES打靶，虽精度可信，但动辄超过一年的漫长周期和繁琐流程令人望而却步；选择高效的CRISPR直接注射，却又为大片段编辑的效率低下、难以避免的嵌合现象与脱靶风险而担忧。

 

是否存在一条兼顾经典技术的精准与新兴技术的效率的“第三条道路”？答案是肯定的。

 

特别推荐：“细胞造小鼠”一步到位构建CKO纯合子小鼠

依托赛业生物专属Cre-ES细胞系（稳定表达Cre重组酶，无外源转染/病毒递送的表达不稳定问题），搭配TurboKnockout^®技术实现“从ES细胞打靶到100%嵌合Founder小鼠”的无缝衔接。快至4个月交付！

 

Cre-ES纯合子小鼠模型构建方案

交付目标	周期	福利价（万元）
5只雄性CKO纯合子	4-5个月	3.45
10只雄性CKO纯合子		3.98
20只雄性CKO纯合子		5.48
40只雄性CKO纯合子		7.48

 

新一代ES基因编辑技术TurboKnockout^®

赛业生物在传统ES打靶技术的基础上，自主研发出了升级版的TurboKnockout^®基因编辑技术，利用优化的纯合ES克隆打靶体系，可筛选基因敲除、敲入、点突变的纯合ES细胞。该技术结合了囊胚前注射和四倍体补偿技术进行显微注射，确保产生的Founder小鼠达到100%嵌合状态，所有组织细胞均完全由外源ES细胞分化发育而来，解决了传统技术中嵌合体比例不稳定的问题。周期快至3个月，可大批量获得基因一致的纯合子小鼠。

 

 

技术类型	TurboKnockout®	传统ES打靶	受精卵显微注射
专利产权风险	×	×	潜在风险
潜在脱靶效应	×	×	√
100%嵌合率	√	×	×
可获得纯合的类型	基因敲除、敲入、点突变	×	基因敲除、点突变 （敲入很难获得纯合）
纯合子获得数量	10-50只	×	1-5只
周期	3-6 months	×	3-6 months

 

TurboKnockout^®基因编辑技术优势

TurboKnockout^®基因编辑技术的核心技术支撑之一——四倍体补偿技术，其原理是通过特殊处理获得仅能发育为胎盘、卵黄囊等胚外组织的四倍体胚胎，将经精准编辑的纯合ES细胞注入后，四倍体胚胎自身无法形成胎儿本体，最终诞生的小鼠个体100%由外源ES细胞分化发育而来。这一技术的关键作用在于它将“基因修饰小鼠的构建”与“小鼠的胚胎发育”这两个过程分离开来，彻底跳过传统技术中复杂的嵌合体阶段，不仅从源头避免了嵌合体小鼠基因型混杂、生殖系传递不确定的问题，更大幅缩短了纯合子小鼠的制备周期，同时保障了同批次小鼠基因背景的高度一致性，为后续实验数据的可靠性提供了核心保障。

 

●F0基因型稳定：结合赛业生物专利TurboKnock显微注射技术和四倍体补偿技术，保障交付的所有F0代小鼠的基因型一致，基因修饰准确、效果稳定；

 

●编辑类型多样化：可进行基因敲除、敲入、点突变或人源化等多种项目类型的基因修饰；

 

●QC体系多样化：细胞阶段除了可进行除常规PCR鉴定外，还可以通过多种手段质检（QC）ES克隆打靶的准确性，包括染色体核型鉴定、Southern Blot鉴定、qPCR鉴定、FACS鉴定等表达检测；

 

●品系选择灵活：赛业生物可提供C57BL/6NCya、C57BL/6JCya、BALB/cAnCya、129S2/SvPasCya等多品系选择。

 

TurboKnockout^®技术100%嵌合率的验证数据

首先我们构建了Rosa26安全位点过表达载体CAG>Luciferase>EGFP质粒，在C57BL/6N WT ES细胞上获得了PCR正确的阳性克隆，之后通过流式验证EGFP正确表达。

 

图1 载体构建、ES克隆筛选及EGFP表达检测

 

我们将上面获得的阳性ES克隆通过显微注射获得阳性Founder小鼠，继而通过常规传代获得纯合F2代雄鼠。把F2雄鼠和C57BL/6N WT雌鼠配繁产生可用于TurboKnockout^®技术显微注射的阳性受体胚胎，通过在该背景胚胎显微注射C57BL/6N WT的ES细胞和未注射ES细胞的空扎受体胚胎，分别产生12.5d胚胎及4周龄的Founder小鼠，验证Founder小鼠Luciferase和EGFP的表达情况。

 

结果显示，12.5d的空扎胚胎相对于注射了C57BL/6N WT ES细胞的胚胎有明显的EGFP表达，将胚胎通过胰酶和DNA酶解离为单细胞后，经流式细胞仪检测，空扎胚胎相对注射了C57BL/6N WT ES细胞的胚胎EGFP也是全部表达的，且注射了C57BL/6N WT ES细胞的胚胎未检测到EGFP阳性细胞泄露表达。

 

图2 12.5d胚胎EGFP荧光拍照及流式检测

 

空扎胚胎和注射了WT ES细胞的胚胎分别移植ICR代孕鼠出生的Founder鼠到4周龄后，分别对2种小鼠做了活体成像，结果显示注射了C57BL/6N WT ES细胞的胚胎未见Luciferase萤光泄露表达（图3.B），同时空扎的胚胎发育而来的小鼠表现为Luciferase强萤光（图3.A），且差异极显著（图3.C P=0.0074）。

 

图3 4周龄Founder鼠活体成像结果

 

为进一步验证注射了C57BL/6N WT ES细胞的胚胎是否有CAG>Luciferase>EGFP细胞嵌合，分别对注射了WT ES细胞的4周龄小鼠取材心、肝、脾、肺、肾和12.5d胚胎组织进行PCR验证，同时添加空扎胚胎做为阳性对照，结果注射了C57BL/6N WT ES细胞的F0小鼠各组织和胚胎均未检测到MT条带。

 

图4 4周龄Founder鼠和12.5d胚胎PCR鉴定

 

（1-5：注射WT ES 1鼠的心、肝、脾、肺、肾；6-10：注射WT ES 2鼠的心、肝、脾、肺、肾；11-15：注射WT ES 3鼠的心、肝、脾、肺、肾；16-21：注射WT ES 12.5d胚胎组织；22-25：12.5d的空扎胚胎组织；26：WT对照；图中加了700bp内参）

 

总结：TurboKnockout^®技术生产的Founder小鼠为100%嵌合状态，所有Founder小鼠的组织细胞均由外源ES细胞分化发育而来。