TurboKnockout®基因编辑技术详解：原理、构建流程、验证数据与应用选择

一、TurboKnockout^®是什么：基因编辑鼠从ES细胞打靶到Founder小鼠

赛业生物在传统ES打靶技术基础上自主研发了TurboKnockout^®基因编辑技术，利用优化的纯合ES克隆打靶体系，筛选基因敲除、敲入和点突变等纯合ES细胞，再结合囊胚前注射及四倍体补偿等胚胎操作技术路线制备小鼠。该路线旨在获得基因型一致的Founder小鼠，减少依赖后续繁育获得目标纯合子的等待。

四倍体补偿的基本思路，是利用四倍体受体对胚外组织的贡献，为供体多能干细胞形成胚体提供支持。胚体与胎盘、卵黄囊等胚外组织应区分理解；实际供体贡献与受体残留需要由检测结果支持。通用四倍体补偿原理与具体平台验证是不同层面的证据，不能用通用原理替代项目实测结果。[1]

项目介绍中提出，符合相应条件的模型周期快至3个月，可批量获得基因型一致的纯合子小鼠。具体项目还需结合编辑类型、克隆筛选、品系、数量和交付标准确定周期。

二、纯合子小鼠构建流程与关键确认点

Founder（F0）表示构建获得的首代小鼠，其实验适用性需要结合构建方式和验证证据判断。关于纯合、双等位基因编辑与嵌合的区别，可进一步阅读F0代纯合子小鼠的实验适用性与质量验证要点。

三、不同基因编辑鼠构建路线如何选择

传统ES打靶需要经历细胞筛选及后续小鼠繁育，部分复杂项目可能超过一年；受精卵直接编辑减少了ES细胞操作环节，但复杂敲入及F0嵌合评估仍需结合项目设计。比较时应同时核对交付阶段、检测要求和研究目的。[2]

数量与周期是对应方案条件下的参考值，不能脱离编辑类型、交付基因型和验收标准直接比较。“100%嵌合”也不应与受精卵编辑成功率混为同一指标。

四、编辑类型、质量控制与品系选择

编辑类型：围绕目标等位基因选择模型

可开展基因敲除、基因敲入、点突变或人源化小鼠等多种项目类型的基因修饰。项目设计应明确修饰范围、目标等位基因以及最终交付的基因型。

细胞阶段QC：从克隆筛选到表达验证

除常规PCR鉴定外，可根据项目需要采用染色体核型鉴定、Southern Blot鉴定、qPCR鉴定及FACS等表达检测，对ES克隆的打靶准确性和相关特征开展质量控制。不同检测回答的问题不同，具体组合及交付资料应在方案中明确。

F0基因型一致性：以筛选后的ES克隆为起点

结合赛业生物专利TurboKnock显微注射技术与四倍体补偿等技术路线，以经鉴定的纯合ES克隆开展小鼠制备，目标是获得基因修饰准确、基因型一致的F0代小鼠。交付模型仍需结合目标位点鉴定及约定的QC结果评估。

遗传背景：按研究需求选择品系

可提供C57BL/6NCya、C57BL/6JCya、BALB/cAnCya、129S2/SvPasCya等品系选择。模型设计时应将遗传背景与对照安排一并确认，具体品系与项目适配性以评估方案为准。

五、Founder细胞来源验证：完整实验与数据解读

评估Founder小鼠的细胞来源，需要将胚胎阶段、出生后阶段以及不同组织的检测结果结合起来。下列实验通过Luciferase与EGFP报告系统，考察受体胚胎标记在注入野生型ES细胞后是否仍可检出。

验证流程：载体构建 → ES打靶 → PCR/FACS验证 → 阳性受体胚胎制作 → F0胚胎及小鼠生产 → 供体ES细胞贡献与受体背景残留检测。

1. Rosa26报告载体构建、ES克隆筛选与表达验证

构建Rosa26安全位点过表达载体CAG>Luciferase>EGFP质粒，在C57BL/6N WT ES细胞上获得PCR鉴定正确的阳性克隆，随后通过流式检测验证EGFP正确表达。

2. 阳性受体胚胎制备与12.5d胚胎EGFP检测

将上述阳性ES克隆通过显微注射获得阳性Founder小鼠，继而通过常规传代获得纯合F2代雄鼠。将F2雄鼠与C57BL/6N WT雌鼠配繁，产生可用于TurboKnockout^®显微注射的阳性受体胚胎。在该背景胚胎中注入C57BL/6N WT ES细胞，并设置未注入ES细胞的空扎受体胚胎对照，分别获得12.5d胚胎及4周龄Founder小鼠，检测Luciferase和EGFP表达。

12.5d空扎胚胎相对于注入C57BL/6N WT ES细胞的胚胎具有明显EGFP表达。将胚胎经胰酶和DNA酶解离为单细胞后，流式检测同样显示空扎对照的EGFP表达；注入WT ES细胞的胚胎未检测到EGFP阳性细胞信号。胚胎图像中的空扎对照与ES注入组分别对应图2.A与图2.B。

3. 4周龄Founder小鼠Luciferase活体成像

将空扎胚胎和注入WT ES细胞的胚胎分别移植至ICR代孕鼠，待出生的Founder小鼠达到4周龄后进行活体成像。注入C57BL/6N WT ES细胞的胚胎发育而来的小鼠未见Luciferase荧光信号（图3.B），空扎胚胎发育而来的小鼠表现为强Luciferase荧光（图3.A）；组间差异具有统计学意义（图3.C，P=0.0074）。

4. 心、肝、脾、肺、肾及胚胎组织PCR验证

为进一步检测受体背景的CAG>Luciferase>EGFP细胞贡献，对注入WT ES细胞的4周龄小鼠取心、肝、脾、肺、肾组织，并对12.5d胚胎组织进行PCR鉴定，加入空扎胚胎作为阳性对照。结果显示，注入C57BL/6N WT ES细胞的F0小鼠所检测组织及胚胎样本中均未检测到MT条带。

泳道说明：1—5为注入WT ES细胞的1号小鼠心、肝、脾、肺、肾；6—10为2号小鼠对应组织；11—15为3号小鼠对应组织；16—21为注入WT ES细胞的12.5d胚胎组织；22—25为12.5d空扎胚胎组织；26为WT对照。图中加入700 bp内参。

5. 如何理解“100%嵌合”与实验结论

技术资料以“100%嵌合状态”描述Founder小鼠的高供体ES细胞贡献。上述荧光、流式、活体成像及多组织PCR结果相互支持：在本实验所检测的时间点、组织样本及方法检测范围内，未检出受体报告基因背景的残留信号。这里的“100%”用于描述细胞来源目标，不等于每次注射均能成功，也不等于检测已经覆盖全部细胞。

报告基因受体胚胎的制备使用了常规F0至F2繁育，这属于验证系统建立过程，应与待构建模型的项目交付周期区分。该实验支持细胞来源层面的评估；目标等位基因准确性、遗传传递及研究所需功能仍应由对应检测确认。

六、从技术选型到人源化及复杂模型应用

该平台可用于完全性或条件性基因敲除小鼠、基因敲入小鼠、点突变及人源化等项目。技术选择应从研究问题出发，将目标等位基因、表达验证与模型用途连接起来，而不是仅以交付速度作为判断依据。

对于人源基因替换、HUGO-GT^®模型及全人源抗体小鼠等需求，可阅读TurboKnockout^®在人源化小鼠构建与模型定制中的应用，进一步梳理替换范围与应用评估重点。

七、Cre-ES纯合子小鼠模型构建方案

“细胞造小鼠”方案结合赛业生物专属Cre-ES细胞系与TurboKnockout^®技术，利用稳定表达Cre重组酶的细胞体系开展模型构建，减少外源转染或病毒递送导致的表达不稳定问题。方案以从ES细胞打靶到高供体贡献Founder小鼠的流程衔接为特点，CKO纯合子小鼠构建方案提出快至4个月交付。

以上价格、数量与周期对应所列Cre-ES构建方案，具体适用范围、交付基因型、检测内容及报价请联系赛业生物确认。方案中的CKO纯合子与目标组织内已经发生重组的功能性敲除状态，应结合具体设计、Cre条件及鉴定结果区分。

参考文献与资料来源

[1] An interspecies barrier to tetraploid complementation and chimera formation. Scientific Reports, 2018. 通用四倍体补偿与谱系贡献背景资料；不作为具体商业项目交付结果的替代证据。

[2] Impact of essential genes on the success of genome editing experiments generating 3313 new genetically engineered mouse lines. Scientific Reports, 2024. 用于Founder嵌合、生殖系传递及构建结果评估的研究背景。

技术流程、实验图片及方案信息来源：赛业生物提供的TurboKnockout^®技术资料。荧光、活体成像和PCR结果的解释以所示实验条件与检测范围为限。

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