样本质量
剪尾、耳组织或其他样本量应适中，避免组织过多、裂解不充分或 DNA 纯度不足影响 PCR 扩增。
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导语：拿到基因编辑鼠后，鉴定工作先排上日程
等待数月的基因编辑鼠终于到了，鉴定工作也该尽快排上日程。毕竟鉴定工作做不好，后续繁殖建系和实验推进都可能被迫重来。今天我们要讲的主题，就是如何鉴定基因编辑技术构建的 基因敲除小鼠。
我们通常拿到手的基因编辑鼠是 F1 代杂合阳性鼠。杂合阳性鼠自交后的后代可能出现野生型、纯合子、杂合子三类基因型，因此需要进一步做纯杂合鉴定。下面就按 F1 代和 F2 代两个阶段，梳理基因型鉴定中最常见的引物设计、预期条带和电泳结果判断逻辑。
在实际项目中，基因型鉴定不只是“跑出条带”这么简单。对于定点基因编辑构建的模型，还要注意 founder 嵌合、大片段缺失、插入缺失边界不一致、PCR 假阴性等问题；必要时应结合 Sanger 测序、拷贝数检测或靶向测序确认编辑结果，再进入稳定繁育和表型实验阶段。
一、F1代阳性杂合鼠（＋/－）鉴定
1. 引物设计
将引物设在敲除片段的两端，野生型小鼠可以扩增出 KO 鼠缺失的片段。不过需要注意的是，若敲除片段过大，有的酶扩增不出野生型片段。例如部分常规扩增体系中，1.5 kb 以下基本可以扩增出条带，大于 1.5 kb 的片段则更容易出现扩增困难。
图1. F1代阳性杂合鼠鉴定的引物设计思路。
2. 预期片段大小
假设条带 1 的大小为扩增的野生型片段大小，条带 2 的大小为扩增的野生型片段大小减去敲除片段大小。根据条带是否出现，即可初步判断该鼠是否携带目标敲除等位基因。
3. 电泳结果
若电泳结果有条带 2，则为 F1 代阳性杂合鼠（＋/－）；若电泳结果没有条带 2，则为阴性鼠或野生型鼠（＋/＋）。如果后续要推进 快速繁育 或扩大实验群体，建议在建系早期就把鉴定流程和记录方式固定下来。
图2. F1代阳性杂合鼠的电泳结果判断。
二、F2代纯杂合鉴定
1. 引物设计
若所用的酶可以扩增出野生型片段，用 F1 代鉴定中的这对引物就可以鉴定纯杂合。当敲除片段过大，而所用酶无法扩增野生型条带时，F1 代鉴定中的这对引物不能用于 F2 代纯杂合判断，因此需要再设计一条位于敲除片段内的引物，位置可靠近 5' 端或 3' 端，三条引物一起扩增后再进行电泳分析。
2. 预期片段大小
假设条带 1 的大小为扩增的野生型片段大小，条带 2 的大小为扩增的野生型片段大小减去敲除片段大小，条带 3 的大小为引物 F 与引物 Wt/He-R 扩增的片段大小。三条带体系的价值在于：当野生型大片段扩增效率不稳定时，仍可借助位于缺失片段内的引物识别野生型等位基因。
3. 野生型片段可以扩增出来时的电泳结果
若电泳结果只有条带 2，则为纯合敲除鼠（－/－）；若电泳结果只有条带 1，则为野生型鼠（＋/＋）；若电泳结果既有条带 1 又有条带 2，则为 F1 代阳性杂合鼠（＋/－）。
图3. 野生型片段可以扩增时的 F2 代纯杂合判断。
4. 野生型片段不能扩增时的电泳结果
若电泳结果只有条带 2，则为纯合敲除鼠；若条带 2 和条带 3 都出现，则为杂合敲除鼠；若只有条带 3，则为野生型鼠。此类场景下，建议重点关注引物特异性、PCR 体系、退火温度和样本 DNA 质量，避免因为扩增失败误判基因型。
图4. 野生型片段不能扩增时的 F2 代纯杂合判断。
三、基因型鉴定前后建议重点核对什么
引物位置
引物应围绕编辑区域合理布局，大片段敲除项目要提前评估野生型片段长度和扩增难度。
条带解释
条带缺失不一定等于目标基因型成立，也可能来自模板质量、PCR 条件或非特异扩增问题。
测序确认
基因编辑项目若涉及小片段 indel、复杂编辑或 founder 嵌合，建议结合测序进一步确认。
| 鉴定阶段 | 重点问题 | 建议处理 |
|---|---|---|
| F0 / founder | 可能存在嵌合或多种编辑等位基因 | 优先结合测序确认，再安排配繁 |
| F1 阳性鼠 | 确认是否稳定传递目标编辑 | 按位点设计 PCR 引物，必要时测序复核 |
| F2 纯杂合 | 区分纯合、杂合与野生型 | 根据片段长度选择双引物或三引物方案 |
四、相关模型与资料入口
如果你正在推进 KO、CKO 或转基因鼠项目，可以先在 KO/CKO小鼠模型 页面查找现货与已有模型资源；如需要从头构建，也可进一步了解 基因敲除小鼠 定制服务。涉及条件性敲除、Cre 系统或组织特异性研究时，可搭配 Cre-loxP重组酶系统使用手册 和 各种类型的基因编辑鼠如何建系 一起阅读。
本文于2026年8月进行了内容更新与校准，补充了基因编辑鼠基因型鉴定中的 founder 嵌合、测序确认和建系阶段核对要点。
FAQ
1. F1代阳性杂合鼠一定能直接用于后续实验吗？
不一定。F1代阳性鼠通常还需要结合项目目的、遗传背景、编辑位点和繁育计划进一步确认。若涉及复杂编辑，建议在建系前做测序或其他验证。
2. 为什么 F2 代有时需要三引物 PCR？
当敲除片段较大、野生型大片段不容易扩增时，仅用两端引物可能无法可靠区分野生型、杂合和纯合，因此可增加一条位于缺失片段内的引物辅助判断。
3. 电泳条带和预期不一致时应先排查什么？
建议先排查样本 DNA 质量、引物特异性、PCR 体系、退火温度和片段长度，再结合阳性、阴性对照判断是否需要重新设计引物或补充测序确认。
关于赛业生物
赛业生物2006年成立，是国家高新技术企业、专精特新“小巨人”企业，是深耕生物医药源头创新的全球化创新性生物技术平台型企业。公司立足新一代AI驱动的全人抗体药物研发与转化平台，以自主基因编辑技术为核心，打造一站式抗体药物研发体系，依托完备的上下游技术矩阵，全面赋能全球创新药研发。
公司核心优势为抗体源头创新，通过自主搭建HUGO-Ab®全人源抗体小鼠平台，集成共轻链技术、纳米抗体技术，结合自研的AbSeek®AI智能计算平台，建设起HUGO-LAb™抗体分子库，围绕肿瘤、自免、代谢等重点疾病方向，建立靶点研究、抗体发现、分子筛选与功能验证的一体化数据体系，并持续沉淀具有开发潜力的候选分子与技术数据资产。赛业生物打造的新一代AI驱动的全人抗体药物研发与转化平台，打通靶点验证、抗体筛选、序列优化和体内外验证全闭环，革新传统试错研发模式，实现可预测、高效率、高成药性、规模化抗体研发。配套HUGO-GT®全基因组人源化小鼠平台，精准支撑靶点验证与功能研究，显著提升生物药临床转化效率。
此外，赛业生物拥有完善的临床前CRO全链条服务能力，覆盖肿瘤、自免、代谢、眼科、神经等疾病领域，可提供模型构建、药理药效评价、机制研究等一体化服务。企业员工超1000人、拥有四万余平研发场地及全球化交付体系，未来将持续迭代核心抗体技术，依托全产业链优势助力全球药企提速创新药研发与落地。
公司核心优势为抗体源头创新，通过自主搭建HUGO-Ab®全人源抗体小鼠平台，集成共轻链技术、纳米抗体技术，结合自研的AbSeek®AI智能计算平台，建设起HUGO-LAb™抗体分子库，围绕肿瘤、自免、代谢等重点疾病方向，建立靶点研究、抗体发现、分子筛选与功能验证的一体化数据体系，并持续沉淀具有开发潜力的候选分子与技术数据资产。赛业生物打造的新一代AI驱动的全人抗体药物研发与转化平台，打通靶点验证、抗体筛选、序列优化和体内外验证全闭环，革新传统试错研发模式，实现可预测、高效率、高成药性、规模化抗体研发。配套HUGO-GT®全基因组人源化小鼠平台，精准支撑靶点验证与功能研究，显著提升生物药临床转化效率。
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