「Q&A实验室」KO你的困惑！基因敲除细胞高频问题合集

RNP是无痕的，后期筛选单克隆没有抗性，无痕是因为RNP使用的是引导分子和核酸酶，转入细胞发生基因编辑，就被降解掉了，也就是除了目的序列发生了编辑，细胞内无其他残留。

（1）利用慢病毒法转染会在敲除靶基因的同时引入新的基因，而且慢病毒转染的外源基因是随机整合，存在影响其他基因表达的风险。

（2）慢病毒法会持续表达，长期存在的核酸酶会对这种脱靶效应有累积效应，最终影响实验的严谨性。

质粒法：通过将含有引导分子和核酸酶基因表达载体瞬时转染到目的细胞中，从而在细胞内表达引导分子和核酸酶，由于质粒（非整合型质粒）整合到基因组的概率极低，随着细胞传代质粒的逐新消失，再经过PCR验证和测序筛选出纯合的敲除细胞。但质粒法也存在一个较大的问题，即转染效率较低。

RNP法：与质粒法不同的是，RNP法是通过电刺激转染的方法直接将引导分子和核酸酶复合物转染到细胞中。由于核酸酶是不带电荷的，而引导分子是带电荷的，因此只有当引导分子和核酸酶结合后，才能更高效地将两者转染到细胞中。同时，由于引导分子和核酸酶会被降解，引导分子和核酸酶复合物在细胞内的存留时间不会很长，因此发生脱靶的概率很低，与其他两种相比，高效、快捷、无残留。

测野生型细胞中包含引导分子的那一段序列，长度一般在300-1000bp。

选择一条引导分子在编码基因的外显子上切割产生DSB(双链断裂)，通过NHEJ非同源性末端修复导形成非3倍数的插入或者缺失，则会造成蛋白翻译时的读码框移码（Framshift），不再产生完整的蛋白，即“移码敲除”；选择一对引导分子同时作用造成两个DSB时，NHEJ修复不仅可造成染色体DNA片段缺失，同时也可能造成缺失后的蛋白读码框移码。小片段敲除除了要考虑敲除的片段区域之外，也要考虑敲除的区域能否引起移码突变。虽然主观上我们很容易认为片段敲除对于蛋白功能域的影响更大，但其实移码跟片段敲除很多时候也可以达到理想的敲除效果。

KO单克隆是指所有细胞均由一个测序验证的单个细胞增殖而来的，所有细胞的基因型都是一样的。KO Cell Pool是指没经过单克隆化和筛选的细胞池，因此可以理解为这群细胞中包含KO纯合子，杂合子和野生型，我们在拿到KO Cell Pool后须根据后续的实验需求挑取单克隆。当需要去除细胞群体干扰因素的时候，推荐使用单克隆稳定细胞株，其基因组背景相对单一，对实验结果干扰因素小。当进行系统生物学研究时，需考虑细胞群体因素，同时由于不同细胞个体差异大，而且不同整合位点的单克隆细胞株表现出来的细胞行为可能不一致，所以许多实验使用混合克隆株更能去除细胞间差异造成的干扰。因此，选择单克隆细胞株还是混合克隆细胞株，需要根据实验目的而定。

主要做了如下三个方面的改进：

（1）优化同源臂设计，选择最优的引导和Donor序列；

（2）优化递送策略；

（3）优化转染方法。