iPSC基因敲除难在哪里？从干性鉴定到三个研究案例读懂关键环节

iPSC是什么？基因编辑研究的细胞背景

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，IPS）与胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES）的功能相似，是由终末分化的细胞经诱导重编程后得到的具有多能干性的细胞。其分化能力强，且与原细胞遗传背景一致，在特定的条件下，IPS细胞能再分化成特定的细胞类型或组织。与原代提取的干细胞相比，IPS细胞具有无道德伦理争议，来源广泛，避免了免疫排斥反应的优点。近年来，CRISPR基因编辑在IPS细胞中的应用越来越受到关注，并在疾病模型的建立与机制研究、细胞治疗、药物的发现与评价等方面有着巨大的潜在应用价值，为整个干细胞生物学领域和临床再生医学提供了新的研究思路。下面给大家介绍IPS的背景知识和联合基因编辑后的应用。

诱导多能干细胞常用缩写为iPSC，本文沿用原文IPS、IPSC等写法时均指该类细胞。细胞来源优势与具体应用的免疫相容性应分别评价，不能把“避免免疫排斥”视为所有iPSC衍生细胞的保证；重编程、培养与编辑后仍需质量检查。

iPSC如何诱导？原理与影响因素

1. 诱导原理

IPS细胞的诱导原理是将外源因子递送至终末分化的细胞中，激活多能性基因的表达，使终末分化的细胞重编程成多能干细胞，即IPS细胞。这些外源因子通常有Oct4、Sox2、Klf4等。

2. 诱导方法

通过逆转录病毒或慢病毒系统，使外源因子的基因序列整合至宿主细胞（如成纤维细胞）中，长期稳定表达外源因子，可以启动终末分化细胞的重编程。这种方法具有较高的诱导效率，但是得到的IPS细胞具有一定的致瘤性。因此为了避免这种风险，也有使用腺病毒或者质粒法等整合至基因组概率低的方法，或者将外源因子直接添加至培养基中使细胞吸收外源因子，但是这些方法也存在一个很大的问题：诱导效率极低。

为了提高诱导效率，一些研究者在诱导体系中添加一些小分子药物或调整培养条件。例如，通过添加小分子药物影响细胞基因组的甲基化程度或特定的信号通路等，从而提高重编程的效率。所以在诱导IPS细胞时，可适当添加小分子药物，提高诱导效率。

另外，受体细胞的类型、状态和传代代数等因素对诱导成功率也有很大的影响。总体来讲，分化程度高的细胞类型的诱导成功率较低。这可能与受体细胞的甲基化修饰和乙酰化修饰等表观遗传修饰有关，使得诱导的条件也不尽相同。所以选择合适的受体细胞进行诱导也很重要。现今常用的受体细胞有原代成纤维细胞，这是由于取材方便和培养简便。

不同诱导方式的效率及风险受细胞背景与具体体系影响，以上描述用于理解原理，不作为跨体系的固定排名或可直接套用的培养方案。

iPSC如何筛选与鉴定？

受体细胞经诱导后，需要经过筛选与鉴定，来获得目的IPS细胞。以相应物种的ES细胞作为对照，从分子和细胞水平进行检测，判断IPS细胞诱导的成功与否。

在分子水平可以检测内源的干性标记基因的表达水平，如：Oct4、Sox2、Nanog等。虽然这些基因的表达水平在不同物种间存在差异，但一般情况下表达都较高。也可以通过免疫荧光染色的方法检测这些标记基因，如果具有阳性信号，也表明具有多能干性。同时还能检测内源干性标记启动子的甲基化程度。此外还需检测端粒酶的活性，来确定IPS细胞的永生化能力。

在细胞层面，能通过观察细胞的形态进行判别：IPS细胞的形态与ES细胞相似，具有生长速度快、集群生长、核质比高、能长期传代和AP染色呈阳性等特点。此外需要检测分化能力和核型，这是由于外源基因整合具有随机性，使诱导得到的 IPS 细胞会有较高比例的核型异常。

干性标记阳性是否等于完成全部质量评价？

不能仅以单一阳性标记作全面判断。本文所述形态、分子标记、分化能力和核型各有检测目的，应结合研究需求理解；端粒酶或某一项染色结果不能独立替代综合鉴定。

在iPSC中敲除细胞基因有哪些研究应用？

CRISPR基因编辑技术可有效且精准地对目的基因进行敲除、点突变和敲入。近年来，CRISPR和IPS细胞分别在基因研究和疾病治疗等方面有着巨大的应用潜力。那么当CRISPR应用于IPS细胞时，就会摩擦出巨大的火花。

通过基因编辑的手段，纠正患者来源的IPS细胞的致病基因，并将纠正后的IPS细胞分化成特定的细胞、组织和器官，移植回患者体内用于治疗，这是IPS细胞与基因编辑联合应用最理想的做法。例如将皮肤或血细胞诱导成IPS细胞，再通过用CRISPR/Cas技术将CISH基因敲除，获得IPSC-CISH^-/-细胞，再分化成IPSC-CISH^-/--NK细胞（图1）。研究结果表明，在白血病异种移植模型中，IPSC-CISH^-/--NK细胞对肿瘤生长具有更强的抑制能力，并且IPSC-CISH^-/--NK细胞在体内的持久性也显著增加。

图1. 在人类IPSC中构建CISH^-/-IPSC-NK细胞^[1]

基因编辑过后的IPS细胞能被诱导成各种细胞、组织和器官，可以构建各种疾病模型，用于基因功能研究、疾病机制探索和药物筛选等。比如Kung等在人类iPSC细胞中敲除了miR-26b（图2），以探索miR-26b在发育和疾病中的作用。该miR-26b敲除的IPS细胞表现出正常的核型，表达多能性标记并分化为三个胚层的细胞。这为研究发育提供了一个良好的实验模型，并阐明了IPSC衍生的人类类器官疾病模型中miR-26b下游调控异常的机制。

图2.IPSC细胞中miR-26b的敲除与鉴定^[2]

如何区分研究设想、模型工具和功能结果？

CISH案例对应iPSC来源NK细胞在白血病异种移植等实验体系中的研究结果，不等同于纠正患者致病变异后回输治疗，也不代表已证明人体疗效。[1] miR-26b研究的直接成果是建立并表征敲除iPSC细胞系，为后续研究提供工具；原文“阐明机制”应按这一证据范围理解，不能等同于已证明所有下游机制。[2]

iPSC基因编辑有哪些难点？

CRISPR和IPS细胞都有着巨大的应用前景，但是将两者完美结合并不是一件容易的事情。要将两者完美结合，受到多方面因素的影响。从前面介绍就可以知道，诱导IPS细胞就是一个复杂且坎坷的过程，存在诱导率低、培养条件苛刻等难点。那么将基因编辑应用于IPS细胞上也会有相似的问题，比如在编辑过程中，IPS细胞的培养条件比普通细胞系苛刻很多，稍不注意会容易使IPS细胞分化，丢失干性。并且在编辑过后，筛选单克隆较为困难，可能产生脱靶情况。

TNFAIP8L2敲除iPSC的鉴定案例

赛业生物在细胞基因编辑和干细胞培养有着多年经验，具备在IPS细胞中实现基因编辑的能力。比如通过CRISPR/Cas基因编辑技术，在诱导性多能干细胞IPS中敲除Human TNFAIP8L2基因。通过小片段的敲除方法，在TNFAIP8L2的2号外显子设置两条sgRNA，敲除2号外显子300 bp（图3）。经过PCR和测序鉴定，确定获得TNFAIP8L2基因敲除的纯合IPS细胞（图4）。再通过免疫荧光染色，检测NANOG、OCT4和SOX2三个干性标记基因，均能检测出阳性信号（图5），表明该敲除细胞具有干性。

图3. hTNFAIP8L2的敲除策略

图4. IPS-hTNFAIP8L2-KO测序检测

图5. IPS-hTNFAIP8L2-KO干性检测

该案例中的约300 bp目标片段、PCR及测序结果用于说明具体编辑设计与基因型鉴定；NANOG、OCT4、SOX2信号用于相应标记检测。两类结果不能互相替代，也不据此推断已完成所有分化能力、遗传稳定性或功能评价。

三个iPSC基因敲除案例的验证重点

在iPSC中敲除细胞基因后，可按目标位点、细胞状态与研究功能分层整理证据。具体检测需求可结合体外检测沟通，避免仅凭一个标记判断模型是否满足全部实验要求。

iPSC基因编辑相关研究资源

可结合研究阶段了解iPSC重编程、iPSC基因编辑及iPSC定向分化。更多资源见技术指南中心；服务入口不等同于临床治疗或临床制备能力的证明。

参考文献

1. Zhu, Huang et al. “Metabolic Reprograming via Deletion of CISH in Human iPSC-Derived NK Cells Promotes In Vivo Persistence and Enhances Anti-tumor Activity.” Cell stem cell . 27,2 （2020）: 224-237.e6.

2. Kung, Louise H W et al. “Generation of a miR-26b stem-loop knockout human iPSC line, MCRIi019-A-1, using CRISPR/Cas9 editing.” Stem cell research. 50 102118. 10 Dec. 2020.

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