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研究背景：衰老与疾病耐受
三羧酸（TCA）循环是一条进化上十分古老的代谢途径，它的主要功能是产生还原当量供给氧化磷酸化，同时生成必需的生物合成前体。自1937年Krebs发现三羧酸循环以来，这条通路就被证明具有高度的灵活性。当缺氧或电子传递链受损时，细胞会通过α-酮戊二酸的还原羧化来维持柠檬酸的合成。细胞甚至可以将柠檬酸输出到细胞质并与苹果酸交换，从而绕过经典三羧酸循环的许多步骤。
或许正是由于这种代谢异质性，三羧酸循环相关基因发生突变的患者表现出多样化的表型，从新生儿的严重神经代谢综合征到成人的神经内分泌和肾脏肿瘤均有报道。确定三羧酸循环每个节点所支持的独特细胞功能，才能理解由三羧酸循环紊乱引起的疾病。顺乌头酸酶2（ACO2）是经典三羧酸循环中第一步代谢柠檬酸的酶，催化柠檬酸异构化为异柠檬酸，但目前尚不清楚在何种条件下细胞需要依靠ACO2推动柠檬酸正向代谢。
美国纪念斯隆·凯特琳癌症中心领导的研究团队探索了三羧酸循环的哪些产物有助于维持细胞适应性。他们证实柠檬酸清除是经典三羧酸循环的一项重要功能。柠檬酸生成量的增加会加剧对ACO2的依赖，而柠檬酸的积累会激活整合应激反应并损害细胞适应性。在体内，ACO2缺失会引发柠檬酸积累，造成肾小管变性损伤。这项研究成果发表在《Cell》杂志上。
图片来源：《Cell》
（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41763199/）
研究材料与方法
研究人员采用[U-13C]葡萄糖标记非小细胞肺癌（NSCLC）细胞，并用苹果酸m+2与柠檬酸m+2比值（mal+2/cit+2）来评价葡萄糖来源碳是否完整走完三羧酸循环。他们用苯乙双胍抑制复合物I，并用解偶联剂FCCP加速电子传递。他们构建了ACO2、CS（柠檬酸合酶）和PDK1基因敲除细胞系，以解析基因功能。研究人员还构建了他莫昔芬诱导的全身条件性Aco2敲除小鼠（其中Aco2fl/fl小鼠由赛业生物提供），并通过饮用水补充外源柠檬酸，以评价柠檬酸负荷对敲除小鼠的影响。
技术路线
明确线粒体呼吸/NAD+再生决定经典三羧酸循环的激活
通过体外实验证实ACO2的核心作用是清除柠檬酸
利用RNA测序和细胞周期等分析评估柠檬酸堆积的影响
利用小鼠模型验证从循环中摄取柠檬酸的肾脏对ACO2高度依赖
研究结果
1. 线粒体呼吸激活经典三羧酸循环
通过[U-13C]葡萄糖示踪实验，研究人员发现不同NSCLC细胞的mal+2/cit+2比值存在差异。基因集富集分析发现，电子传递链（ETC）组分的基因表达与mal+2/cit+2比值成正相关。ETC接受三羧酸循环产生的还原当量并最终还原氧气，因此氧消耗量可以作为ETC通量的指标。与此一致的是，在多个NSCLC细胞系中，氧消耗量也与mal+2/cit+2比值高度相关。这些结果表明线粒体呼吸与经典三羧酸循环中的碳保留相关。
利用复合物I抑制剂苯乙双胍处理后，他们发现mal+2/cit+2比值呈剂量依赖性下降。解偶联剂FCCP可增加ETC的电子流，增强柠檬酸m+2标记，并提高mal+2/cit+2比值，而苯乙双胍则逆转了FCCP诱导的mal+2/cit+2比值升高，表明葡萄糖来源的碳进入三羧酸循环以及在三羧酸循环内保留，均依赖于ETC中的电子流。NADH氧化酶mitoLbNOX绕过ETC直接再生线粒体NAD+，同样可以促进经典的三羧酸循环。
2. 丙酮酸氧化决定三羧酸循环中的碳保留
三羧酸循环中的多种酶都需要NAD+作为必需辅因子，那么是哪些节点控制了三羧酸循环内的代谢物保留（图1）？丙酮酸脱氢酶（PDH）不仅以NAD+作为辅因子，还受NAD+调控的PDH激酶（PDK）磷酸化影响。苯乙双胍可增加NSCLC细胞中的PDH磷酸化，而mitoLbNOX的表达则降低了PDH的基础磷酸化水平，并阻止了苯乙双胍诱导的磷酸化（图1）。
研究人员还发现，利用二氯乙酸抑制所有PDK可以提高mal+2/cit+2比值，而抑制线粒体丙酮酸转运蛋白会降低mal+2/cit+2比值。PDK1编辑可增强PDH活性，并提高mal+2/cit+2比值。利用苯乙双胍阻断NAD+再生后，PDK1缺陷型细胞仍能维持mal+2/cit+2比值（图1），表明即使线粒体NAD+再生受损，持续的PDH通量也足以维持经典三羧酸循环的活性。
那么，PDH如何影响柠檬酸是否被捕获并进入三羧酸循环？顺乌头酸酶2（ACO2）有高度可逆性，其平衡常数有利于柠檬酸生成。他们发现，在NSCLC细胞系中，总柠檬酸水平与经典三羧酸循环的活性相关，而增加经典三羧酸循环利用率的干预措施，包括mitoLbNOX表达、PDK1缺失以及添加丙酮酸，均增加了柠檬酸池（图1）。这些结果表明，线粒体NAD+再生将丙酮酸氧化为柠檬酸，最终推动了完整三羧酸循环中的碳捕获与保留。
图1 丙酮酸氧化决定三羧酸循环中的碳保留[1]
3. ACO2通过清除柠檬酸来支持细胞适应性
接下来，研究人员探究了三羧酸循环中正向通量的增强是否有助于提高细胞适应性。在常规培养条件下，ACO2敲除对柠檬酸池和细胞增殖仅有微弱的影响，但在外源补充丙酮酸以增加线粒体柠檬酸生成后，ACO2缺失的癌细胞和正常细胞均出现柠檬酸大量堆积，且表现出显著的生长缺陷，这表明线粒体丙酮酸代谢会导致对经典三羧酸循环的依赖。
为此，他们又敲除了细胞中的柠檬酸合酶（CS），以阻止线粒体从丙酮酸产生柠檬酸。值得注意的是，CS敲除完全逆转了ACO2缺失细胞中丙酮酸诱导的生长缺陷，这表明细胞损伤来源于线粒体柠檬酸的过度堆积，而不是三羧酸循环下游中间产物的缺失。长期竞争实验也证实了ACO2通过防止柠檬酸过量堆积来支持细胞适应性。将线粒体柠檬酸转运蛋白SLC25A1过表达，促进柠檬酸排出线粒体，可部分恢复ACO2缺失细胞的增殖能力，进一步证实线粒体柠檬酸堆积是毒性来源。这些结果表明，ACO2的活性可防止柠檬酸在线粒体内有害积累，而当线粒体柠檬酸代谢受损时，增强胞质柠檬酸分解代谢可改善细胞适应性。
4. 柠檬酸堆积激活整合应激反应
为了评估柠檬酸堆积的影响，研究人员分析了ACO2缺陷型细胞的线粒体功能。RNA测序后的基因集富集分析表明，ACO2缺陷型细胞在经过丙酮酸处理后，与整合应激反应（ISR）相关的基因集呈现一致富集，且ISR相关基因是诱导程度最高的基因之一（图2），这种诱导作用在CS缺失后被逆转。
ISR由真核翻译起始因子2α（eIF2α）磷酸化启动，可导致mRNA翻译的整体下降。与ISR激活一致，eIF2α仅在丙酮酸处理的ACO2缺陷型细胞中发生磷酸化，且该细胞表现出整体翻译水平的显著下降，这一表型可通过CS共缺失完全逆转（图2）。翻译水平下降在丙酮酸添加后数小时开始，与细胞内柠檬酸浓度峰值同时出现，表明线粒体柠檬酸的积累与ISR的激活有关。进一步分析发现，丙酮酸补充造成S期和G2/M期细胞减少，而G1期细胞积累增多。这些数据支持以下结论：线粒体中柠檬酸的产生超过其清除能力，进而触发ISR激活，导致翻译起始的整体抑制，并造成G1期细胞周期阻滞。
图2 柠檬酸积累激活了整合应激反应[1]
5. ACO2缺失造成肾脏柠檬酸积累和肾小管损伤
为了确定ACO2是否限制体内柠檬酸的积累，研究人员构建了他莫昔芬诱导的全身条件性Aco2敲除小鼠模型（其中Aco2fl/fl小鼠由赛业生物提供）。敲除后多个组织Aco2表达下降，血清和肾脏中的柠檬酸水平升高，而三羧酸循环中的其他代谢物基本未发生变化。此外，Aco2fl/fl小鼠的肾皮质上皮细胞出现明显的空泡变性，且肾损伤标志物NGAL显著上调，同时肾脏组织ISR通路大量激活，近端小管特征基因下调，这表明ACO2的缺失会诱导肾脏组织损伤。
考虑到肾脏是唯一从循环中净摄取柠檬酸的器官，且近端小管高表达柠檬酸转运蛋白 SLC13A2，研究人员认为柠檬酸摄取可能导致对ACO2介导的柠檬酸清除产生依赖性。他们在饮用水中添加了3%的柠檬酸钠，发现ACO2敲除小鼠的循环柠檬酸水平显著升高，生存期缩短一半，同时肾脏ISR激活和肾损伤分子特征进一步加剧。在体外实验中，过表达SLC13A2赋予HepG2细胞柠檬酸摄取能力。在ACO2缺失后，胞外柠檬酸就足以诱导细胞死亡并显著抑制增殖，这表明细胞自主性的柠檬酸摄取足以增加对ACO2清除功能的依赖。
研究结论
图3 柠檬酸清除是经典三羧酸循环的重要功能[1]
总的来说，这项研究表明，柠檬酸清除是ACO2的一项核心生理功能。ACO2酶的平衡常数本身偏向生成柠檬酸，只有当上游PDH驱动柠檬酸大量合成时，才会推动ACO2正向代谢柠檬酸。当柠檬酸产生超过清除能力，线粒体柠檬酸积累会触发整合应激反应，抑制翻译并损害细胞增殖（图3）。这项工作更新了对经典三羧酸循环的认知，表明三羧酸循环不仅是物质合成和能量代谢枢纽，还承担了代谢物清除的重要职责。
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参考资料
[1]Xie A, Brunner JS, et al. Citrate clearance is a major function of aconitase 2 in the canonical TCA cycle. Cell. 2026 Apr 30;189(9):2684-2699.e21. doi: 10.1016/j.cell.2026.01.028.
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iCyagen面向科研信息检索与研究问题梳理，可作为了解基因、疾病、模型及实验设计思路的辅助入口，帮助研究者组织前期资料和需要进一步验证的问题。
围绕本文的TCA循环、柠檬酸清除与肾损伤研究，可结合iCyagen梳理Foxo1–Aco2通路、年轻与老年小鼠比较、组织特异性遗传模型及心脏/多器官损伤读数。平台辅助信息仍需结合原始文献、模型验证资料与具体实验条件核实，不能替代实验验证。
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FAQ
ACO2在该研究中的核心作用是什么？
原文通过基因干预和代谢实验支持ACO2在柠檬酸生成负荷升高时防止有害积累，不能仅将其作用理解为提供下游中间产物。
为什么研究同时敲除ACO2和CS？
CS缺失阻止线粒体生成柠檬酸，并逆转相应ACO2缺失细胞的生长及应激表型，用于检验损伤是否来自柠檬酸积累。
Aco2小鼠模型提供了什么体内证据？
原文使用诱导型全身条件性敲除体系观察循环和肾脏柠檬酸、ISR与肾损伤变化，并结合外源柠檬酸负荷验证。
