Nat Commun:哈尔滨医科大学团队揭示心力衰竭的驱动因素Bclaf1

为了探究Bclaf1在HFrEF中的作用，研究人员首先评估了HF患者及非HF对照心脏组织中Bclaf1的表达。与对照相比，HF患者心肌组织中Bclaf1 mRNA和蛋白质水平显著升高。在TAC术后10周，小鼠出现严重的心脏功能损伤，且肥厚标志物β-MHC显著上调。重要的是，TAC小鼠心肌中的Bclaf1表达在转录和翻译水平均显著上调。利用AngII刺激新生小鼠心肌细胞后，Bclaf1 mRNA和蛋白质水平均显著升高。这些结果显示，Bclaf1在人类衰竭心肌、小鼠心力衰竭模型和应激心肌细胞中呈现出一致上调，表明Bclaf1在HFrEF发病机制中发挥潜在作用。

为了确定Bclaf1在衰竭心脏中的表达升高是否会直接导致心脏病理，研究人员生成了心肌细胞特异性的Bclaf1转基因小鼠（Bclaf1-TG，由赛业生物提供）。与野生型（WT）小鼠相比，Bclaf1-TG小鼠自出生后11周起死亡，14周存活率显著降低（图1）。超声心动图分析显示，Bclaf1-TG小鼠存在严重的心脏功能障碍，具体表现为射血分数（EF%）和缩短分数（FS%）显著降低、心室扩张和室壁变薄；形态学评估显示心脏显著增大，心脏重量/体重比（HW/BW）增加（图1）。

组织学分析显示，Bclaf1-TG心脏的心肌细胞横截面积增加，间质纤维化显著增加。纤维化相关标志物（Col1a1、Col3a1、Tgfb1和Acta2）表达上调，肥厚标志物心房利钠肽（ANP）和β-MHC表达也显著上调。将Bclaf1过表达质粒（赛业生物提供）导入原代心肌细胞后，同样观察到肥大表型和肥厚基因表达上调。这些结果表明心脏特异性Bclaf1过表达可诱导严重的心肌肥大。

接下来，研究人员构建了心肌细胞特异性的Bclaf1基因敲除小鼠（Bclaf1-cKO，由赛业生物提供）。在TAC术后10周，与WT小鼠相比，Bclaf1-cKO小鼠的存活率显著提高。重要的是，Bclaf1缺失保留了TAC小鼠的心脏功能，具体表现为EF%和FS%升高，心室肥厚、扩张与间质纤维化明显减轻，肥厚标志物ANP和β-MHC表达显著下调。在体外，利用siRNA沉默Bclaf1可以逆转AngII诱导的心肌细胞肥大。这些结果表明，Bclaf1的敲除或敲降可缓解压力负荷或AngII诱导的心衰表型。

之后，研究人员深入探究了Bclaf1调控HFrEF的分子机制。免疫荧光染色的结果显示，TAC小鼠心肌细胞中的Bclaf1强度显著升高，特别是在细胞核中。在对WT和Bclaf1-TG小鼠的心肌细胞进行细胞核RNA测序后，他们发现差异基因主要集中在心肌肥厚通路，其中Hand2在Bclaf1-TG心脏中表现出最明显的上调，它是心肌细胞肥大的关键转录调控因子。

考虑到Bclaf1参与mRNA前体的剪接，他们分析了Bclaf1是否通过pre-mRNA剪接调节Hand2的表达。与WT小鼠相比，Bclaf1-TG小鼠的Hand2总mRNA和成熟mRNA水平显著增加，而pre-mRNA水平显著降低。CLIP-qPCR分析证实，Bclaf1与Hand2前体mRNA第2外显子的TGA下游区域有很强的结合亲和力（图2）。利用模拟内源性Hand2结构的剪接报告基因，他们发现Bclaf1过表达提高了Hand2总mRNA和成熟mRNA水平的水平，并降低了pre-mRNA的水平。加入剪接抑制剂PLAB可以完全逆转Bclaf1介导的Hand2成熟mRNA水平升高（图2）。这些结果表明，Bclaf1作为剪接调节因子，与Hand2 pre-mRNA特异性结合并提高其剪接效率，最终提高Hand2蛋白水平。

为了阐明Bclaf1如何调节Hand2剪接，研究人员通过质谱分析鉴定了心肌细胞中与Bclaf1相互作用的蛋白质。在筛选出40个RNA剪接相关因子后，通过与RNA结合蛋白质数据库交叉比对，他们将分析重点放在剪接因子Srsf2上。免疫共沉淀实验证实，Bclaf1与Srsf2在心肌细胞内存在直接相互作用。Bclaf1过表达提高了剪接效率，但同步敲降Srsf2则消除了这些影响。重要的是，Srsf2缺失消除了Bclaf1诱导的Hand2蛋白上调。这些数据证实，Bclaf1需要招募Srsf2形成复合物，才能完成对Hand2 pre-mRNA的高效剪接。

为了评估Bclaf1抑制的治疗潜力，研究人员用腺相关病毒载体（AAV9-Bclaf1-KD，由赛业生物提供）来实现小鼠心脏特异性Bclaf1部分敲降。在TAC术后8周给药，他们发现TAC小鼠的存活率提高，更重要的是心脏功能显著改善。经过AAV9-Bclaf1-KD处理的TAC小鼠心室体积缩小，间质纤维化减少，且肥厚标志物水平降低。此外，他们还尝试在TAC术后2周给药作为预防性干预措施。结果显示，TAC小鼠的心脏功能同样有了明显改善。这些数据表明，治疗性或预防性Bclaf1敲降可挽救心脏功能障碍并逆转心室重构。

同样，他们还验证了Hand2敲降是否能逆转压力负荷诱导的HfrEF。向TAC小鼠注射AAV9-shHand2（由赛业生物提供），能够显著改善小鼠的心脏功能，减轻心脏间质纤维化和心脏扩大，并伴随着纤维化相关标志物和肥厚标志物的下调。在体外沉默原代心肌细胞中的Hand2也消除了AngII诱导的肥厚标志物上调。由此可见，治疗性Hand2敲降可挽救心脏功能障碍并逆转心肌重塑。