人源化小鼠如何构建？TurboKnockout®在基因替换与模型定制中的应用

一、人源化小鼠构建：先明确研究目标与替换范围

人源化模型设计应从研究问题出发，明确目标基因、拟替换序列范围、是否引入突变、遗传背景及对照需求。“人源化”名称本身不能说明模型包含哪些序列，也不能代替具体等位基因信息。

HUGO-GT^®全基因组人源化模型围绕相应靶基因进行原位人源化，并不表示将小鼠全部基因组替换为人类基因组。具体模型覆盖的编码区、内含子、UTR及调控元件，应按目标模型资料逐一确认。HUGO-GT^®模型入口可用于检索相应资源。

这些方向可共同依托基因修饰技术，但应分别确认模型目标和验收指标，不能只根据同一平台名称推定具体模型已具备所需功能。

二、HUGO-GT^®：从鼠源基因原位替换到突变定制

基于自主研发的TurboKnockout^®技术，赛业生物通过鼠源基因原位替换构建HUGO-GT^®全基因组人源化模型，覆盖多种干预靶点。结合大片段载体融合技术，该模型可作为针对性突变定制的基础，为遗传性疾病及基因治疗药物的临床前研究提供工具。

从模型设计到研究使用，应明确人源化范围与后续突变的关系，并将模型本身的人源化影响与拟研究变异的影响区分评估。“模板”价值应落实到具体位点、序列和对照设计，不能推定每种模型均适配所有突变与干预。

在HUGO-GT^®模型基础上，可结合眼科药效评价、神经及肌肉药效评价、肿瘤药效评价及基因治疗CRO服务，围绕研究目的衔接模型与后续检测。

三、HUGO-Ab^®：全人源抗体小鼠与抗体发现需求

面向创新性全人抗体药物研发，赛业生物基于自主研发的TurboKnockout^® ES打靶技术构建了HUGO-Ab^®全人源抗体小鼠。该系列通过人类免疫球蛋白基因相关设计，支持体内全人源抗体产生及后续发现研究，关注抗体亲和力、序列多样性和免疫原性相关评估。

系列资源包括HUGO-Mab^®单克隆抗体平台、HUGO-Light^™双/多特异性抗体平台与HUGO-Nano^™纳米抗体平台，分别承接全人单克隆抗体、共轻链相关抗体设计及纳米抗体相关研发需求。应根据目标抗体形式和具体模型资料选择资源。

HUGO-Ab^®系列资料介绍了人源抗体重链、Kappa与Lambda轻链可变区germline基因相关资源及丰富的抗体序列多样性。其应用已获得跨国药企、生物制药公司与学术机构采用和认可；具体构型覆盖、抗体亲和力及免疫原性表现，应结合相应产品资料及实验评价确认。

四、TurboKnockout^®如何衔接ES细胞编辑与小鼠制备

赛业生物在传统ES打靶技术基础上研发了TurboKnockout^®基因编辑技术，通过优化的纯合ES克隆打靶体系筛选敲除、敲入和点突变等纯合ES细胞，再结合囊胚前注射与四倍体补偿等技术路线进行小鼠制备，目标是减少传统嵌合体筛选环节并提高Founder基因型一致性。

四倍体补偿通过四倍体受体与供体多能干细胞的谱系贡献差异，为供体细胞形成胚体提供支持。胚体与胚外组织应分别理解，具体项目的细胞来源仍需实验检测确认。[1]

符合相应条件的基因修饰项目周期快至3个月，可批量获得基因型一致的纯合子小鼠。人源化项目的具体周期仍需结合替换设计、细胞筛选、品系、数量及交付验证确定，不能仅由通用技术周期推算。

关于完整技术选型与构建流程，可阅读TurboKnockout^®技术原理、流程与验证数据；如需判断首代模型能否进入实验，可阅读F0代纯合子小鼠的嵌合风险与验证要点。

五、把技术优势转化为人源化项目验收要点

编辑类型：围绕目标等位基因选择模型

可开展基因敲除、基因敲入、点突变或人源化小鼠等多种项目类型的基因修饰。项目设计应明确修饰范围、目标等位基因以及最终交付的基因型。

细胞阶段QC：从克隆筛选到表达验证

除常规PCR鉴定外，可根据项目需要采用染色体核型鉴定、Southern Blot鉴定、qPCR鉴定及FACS等表达检测，对ES克隆的打靶准确性和相关特征开展质量控制。不同检测回答的问题不同，具体组合及交付资料应在方案中明确。

F0基因型一致性：以筛选后的ES克隆为起点

结合赛业生物专利TurboKnock显微注射技术与四倍体补偿等技术路线，以经鉴定的纯合ES克隆开展小鼠制备，目标是获得基因修饰准确、基因型一致的F0代小鼠。交付模型仍需结合目标位点鉴定及约定的QC结果评估。

遗传背景：按研究需求选择品系

可提供C57BL/6NCya、C57BL/6JCya、BALB/cAnCya、129S2/SvPasCya等品系选择。模型设计时应将遗传背景与对照安排一并确认，具体品系与项目适配性以评估方案为准。

六、构建基础证据：Founder细胞来源的完整验证实验

该验证实验围绕报告基因受体背景中的残留贡献展开：先制备带有Luciferase与EGFP标记的受体胚胎，再注入未携带该报告标记的野生型ES细胞，通过胚胎荧光、流式、活体成像和组织PCR进行交叉检测。这里的Rosa26报告系统用于评估细胞来源，不能替代具体人源化靶位点的结构和功能验证。

验证流程：载体构建 → ES打靶 → PCR/FACS验证 → 阳性受体胚胎制作 → F0胚胎及小鼠生产 → 供体ES细胞贡献与受体背景残留检测。

1. Rosa26报告载体构建、ES克隆筛选与表达验证

构建Rosa26安全位点过表达载体CAG>Luciferase>EGFP质粒，在C57BL/6N WT ES细胞上获得PCR鉴定正确的阳性克隆，随后通过流式检测验证EGFP正确表达。

2. 阳性受体胚胎制备与12.5d胚胎EGFP检测

将上述阳性ES克隆通过显微注射获得阳性Founder小鼠，继而通过常规传代获得纯合F2代雄鼠。将F2雄鼠与C57BL/6N WT雌鼠配繁，产生可用于TurboKnockout^®显微注射的阳性受体胚胎。在该背景胚胎中注入C57BL/6N WT ES细胞，并设置未注入ES细胞的空扎受体胚胎对照，分别获得12.5d胚胎及4周龄Founder小鼠，检测Luciferase和EGFP表达。

12.5d空扎胚胎相对于注入C57BL/6N WT ES细胞的胚胎具有明显EGFP表达。将胚胎经胰酶和DNA酶解离为单细胞后，流式检测同样显示空扎对照的EGFP表达；注入WT ES细胞的胚胎未检测到EGFP阳性细胞信号。胚胎图像中的空扎对照与ES注入组分别对应图2.A与图2.B。

3. 4周龄Founder小鼠Luciferase活体成像

将空扎胚胎和注入WT ES细胞的胚胎分别移植至ICR代孕鼠，待出生的Founder小鼠达到4周龄后进行活体成像。注入C57BL/6N WT ES细胞的胚胎发育而来的小鼠未见Luciferase荧光信号（图3.B），空扎胚胎发育而来的小鼠表现为强Luciferase荧光（图3.A）；组间差异具有统计学意义（图3.C，P=0.0074）。

4. 心、肝、脾、肺、肾及胚胎组织PCR验证

为进一步检测受体背景的CAG>Luciferase>EGFP细胞贡献，对注入WT ES细胞的4周龄小鼠取心、肝、脾、肺、肾组织，并对12.5d胚胎组织进行PCR鉴定，加入空扎胚胎作为阳性对照。结果显示，注入C57BL/6N WT ES细胞的F0小鼠所检测组织及胚胎样本中均未检测到MT条带。

泳道说明：1—5为注入WT ES细胞的1号小鼠心、肝、脾、肺、肾；6—10为2号小鼠对应组织；11—15为3号小鼠对应组织；16—21为注入WT ES细胞的12.5d胚胎组织；22—25为12.5d空扎胚胎组织；26为WT对照。图中加入700 bp内参。

5. 如何理解“100%嵌合”与实验结论

技术资料以“100%嵌合状态”描述Founder小鼠的高供体ES细胞贡献。上述荧光、流式、活体成像及多组织PCR结果相互支持：在本实验所检测的时间点、组织样本及方法检测范围内，未检出受体报告基因背景的残留信号。这里的“100%”用于描述细胞来源目标，不等于每次注射均能成功，也不等于检测已经覆盖全部细胞。

报告基因受体胚胎的制备使用了常规F0至F2繁育，这属于验证系统建立过程，应与待构建模型的项目交付周期区分。该实验支持细胞来源层面的评估；目标等位基因准确性、遗传传递及研究所需功能仍应由对应检测确认。对于人源化项目，还需独立确认替换区域、表达及功能适用性。

七、从人源化应用延伸到其他基因修饰模型

除上述模型外，赛业生物还提供完全性基因敲除与条件性基因敲除小鼠、基因敲入小鼠，以及利用KO-First技术灵活设计完全性或条件性敲除的项目服务，为药物筛选、信号通路分析及遗传机制解析提供工具。具体等位基因状态及后续重组或繁育安排应在方案中明确。

发起人源化项目评估时，建议提供目标基因、拟替换范围、人源序列或变异信息、研究用途、遗传背景及交付数量需求，并说明需要的表达与功能验证。先明确这些信息，再选择现有模型或定制路线，有助于使构建方案与后续研究相衔接。

参考文献与资料来源

[1] An interspecies barrier to tetraploid complementation and chimera formation. Scientific Reports, 2018. 通用四倍体补偿与谱系贡献背景资料；不作为具体商业项目交付结果的替代证据。

技术流程、实验图片及方案信息来源：赛业生物提供的TurboKnockout^®技术资料。荧光、活体成像和PCR结果的解释以所示实验条件与检测范围为限。

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