Cell and Bioscience丨云南大学程郢课题组建立并转录组分析人类神经发育障碍小型猪模型

人类神经发育障碍（neurodevelopmental disorders, NDDs），如自闭症谱系障碍（Autism spectrum disorders, ASD）和智力障碍（Intellectual disability, ID）[1]，是致残率最高的儿童精神疾病，被认为是多基因遗传因素和外界环境因素共同作用引起的疾病，但其具体发病机制尚有诸多不明[2,3]。目前NDD发病机制研究多基于啮齿类动物模型，而由于脑结构和基因同源性的差异，这些动物模型不能完全模拟NDD的重要临床特征[4]。因此建立与人在结构和生理上更相似的大动物模型对探明NDD发病机制和筛选靶点药物有重要价值[5]。 

 2024年6月28日，云南大学生物医药研究院程郢教授联合云南农业大学魏红江教授、赵红业教授在Cell and Bioscience杂志发表了题为“Generation and transcriptomic characterization of MIR137 knockout miniature pig model for neurodevelopmental disorders”的研究论文，在小型猪模型中证明了MIR137缺失对神经发育及相关疾病的影响，明确了小型猪可作为神经发育障碍的新型动物模型，为其在人类神经发育障碍疾病研究中的潜在应用提供理论依据。   

  图片来源：《Cell and Bioscience》 

研究材料与方法    

在本研究中，研究人员利用云南特色实验动物“滇南小耳猪”成功建立了精神疾病风险基因MIR137敲除的小型猪模型，并同时使用了小鼠模型及hiPSC及诱导细胞系模型。 

在研究中采用了多项技术，包括基于CRISPR/ Cas9的基因编辑技术、体细胞核移植技术、无PCR全基因组测序技术及分析、Western blotting、hiPSC的诱导分化、免疫荧光、转录组测序及分析等。    

技术路线

研究结果  

首先，研究人员利用云南特色实验动物“滇南小耳猪”，通过CRISPR/Cas9和体细胞核移植技术成功地获得了精神疾病风险基因MIR137敲除（MIR137–/–）的小型猪模型，利用无PCR全基因组测序技术（PCR-free whole genome sequencing, WGS）验证了基于CRISPR/ Cas9的MIR137基因编辑缺失效率，并从分子水平验证了小型猪模型中miR-137的缺失。  

图1 MIR137基因敲除（MIR137–/–）小型猪的构建。A MIR137–/–小型猪模型的构建实验流程。PFF：猪胎儿成纤维细胞。B 猪MIR137基因中sgRNA靶向位点示意图。C 通过体细胞核移植（SCNT）技术移植的MIR137–/–小型猪模型的胚胎数据汇总。D 新生MIR137–/–仔猪的代表性图片。E MIR137–/–小型猪的PCR基因分型结果。F 无PCR全基因组测序（WGS）的基因组覆盖度。G 无PCR全基因组测序分析显示基因组中MIR137存在74 bp的缺失。H MIR137–/–小型猪与野生型（WT）对照小型猪中成熟miR-137表达水平的定量RT-PCR分析。数据以均值±标准误表示，统计学显著性采用双尾t检验，****p < 0.0001[6]  

野生型（wild-type, WT）对照小型猪与MIR137–/–小型猪模型大脑皮层的转录组分析显示出由于miR-137缺失造成的基因表达显著差异。基因本体论（Gene Ontology, GO）分析显示这些差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）在神经系统发育、细胞定位和突触信号传导相关的生物进程中显著富集，通路分析显示DEGs在神经元系统发育、化学突触传递和轴突引导等通路显著富集中。转录组数据与疾病关联性分析显示，MIR137–/–小型猪大脑中DEGs中包括大量与ID和癫痫相关的基因，与人类ASD病人脑组织转录组数据高度一致，表明在小型猪脑中miR-137的缺失会导致与神经发育相关的基因失调，而这些基因的失调可能是NDD的发病机制。  

图2 MIR137缺失导致小型猪大脑出现显著转录组变化。A RNA测序实验流程。B 野生型（WT，n=3）与MIR137–/–（n=2）小型猪的主成分分析。C 差异表达基因（DEGs）火山图。在MIR137–/–小型猪大脑中共鉴定出2117个上调基因和1903个下调基因（阈值标准：log2倍数变化>1或<-1，且校正后p值<0.05）。D-F MIR137–/–小型猪大脑中DEGs的TOP5基因本体（GO）（D）、富集通路（E）及疾病关联（F）分析。G 热图显示MIR137–/–小型猪大脑DEGs与三个不同ASD患者脑组织数据集中DEGs的重叠基因表达模式。[6]  

为了评估小型猪模型是否能更准确地表现人类NDD的发病机制，研究人员进一步构建并使用MIR137缺失的人类诱导多能干细胞（hiPSC，由赛业生物提供）分化而来的前脑神经元（hiPSC-derived neuron）进行了跨物种比较分析。结果显示，相较于MIR137–/–小鼠，MIR137–/–小型猪展现出更多与MIR137–/– hiPSC-derived neuron的转录组分析结果更一致的关键神经元基因、ASD和ID风险基因的变化，表明MIR137–/–小型猪模型可能更好地反映了人类新生儿阶段miR-137缺失导致的关键神经元基因变化，并在分子水平上可作为可靠的人类NDD疾病机制研究模型。  

图3 小鼠、猪及hiPSC来源神经元模型中miR-137缺失的比较分析。A MIR137基因敲除小鼠的构建。通过同源重组设计载体靶向小鼠胚胎干细胞中的MIR137基因，在MIR137基因上游（约2 kb）和下游（约0.6 kb）插入两个loxP位点（上图）。与Zp3-Cre小鼠交配后实现生殖细胞特异性Mir137缺失，自交获得纯合Mir137敲除（Mir137–/–）小鼠（下图）。B MIR137敲除hiPSC来源前脑神经元的构建。设计特异性sgRNA靶向人类MIR137基因，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术通过电转将Cas9/sgRNA导入hiPSC。筛选获得CRISPR/Cas9诱导的MIR137缺失单克隆细胞（MIR137–/–），并诱导分化为神经前体细胞（NPCs）和前脑神经元。C qPCR验证MIR137–/– hiPSC来源NPCs和前脑神经元中成熟miR-137表达降低。数据以均值±标准误表示，统计学显著性采用非配对t检验，*p < 0.001，**p < 0.0001。D 猪、小鼠及hiPSC来源前脑神经元中DEGs的数量及占比。使用Ensembl Biomart将小鼠和猪基因符号转换为人类基因符号进行跨物种比较，无法转换的基因被排除分析。E-F Mir137–/–小鼠脑组织（E）与MIR137–/– hiPSC来源前脑神经元（F）中DEGs的TOP5基因本体条目、富集通路及疾病关联分析。G 跨物种神经元标志基因表达热图。与MIR137–/–小型猪DEGs重叠的神经元标志基因，数据来源于公共数据库（http://xteam.xbio.top/CellMarker/）。H UpSet图展示小型猪、小鼠、hiPSC来源前脑神经元DEGs与ASD、ID及精神分裂症（SCZ）相关基因的交集关系。[6]  

研究人员进一步对MIR137–/–小型猪模型中人类特异性miR-137靶标鉴定的结果发现，在83个显著富集的上调基因中，有8个基因被报道为ASD风险基因，以及7种基因与ID发生相关。鉴于miR-137在ASD中的潜在作用，研究人员构建了一个预测的ASD基因网络，并发现在上调的miR-137靶基因中，尤其CAMK2A和CACNA1H两种基因，可能会影响与ASD和ID相关的邻近基因的表达，包括CAMK2B、GRIN1和CACNA1G。其中，CAMK2A作为一个关乎大脑学习、记忆、突触可塑性和神经元信号等功能的关键基因，仅在MIR137–/–小型猪模型中发现显著上调，而在MIR137–/–小鼠模型中未检测到差异表达。  

图4 MIR137–/–小型猪中人类特异性miR-137靶基因的鉴定。A 在MIR137–/–小型猪中上调的DEGs显著富集于人类miR-137靶基因(从TargetScanHuman 8.0获取的1314个基因)。其中8个基因与ASD相关，7个基因与ID相关。B 通过qPCR验证MIR137–/–小型猪模型中筛选出的人类miR-137靶基因表达情况。C miR-137介导的ASD风险基因互作网络调控。构建了一个预测的ASD基因网络，探索了ASD风险基因之间的大脑特异性相互作用，包括在MIR137–/–小型猪脑部选定的上调miR-137靶基因(粗线标记的点)。上调的miR-137预测靶基因可能影响邻近ASD候选基因的表达，如先前报道与ASD和ID相关的CAMK2B、GRIN1和CACNA1G。D 预测分析发现843个基因同时是人类和小鼠miR-137的靶标。E 在MIR137–/–小型猪中上调的21个DEGs是人类特异性的miR-137靶基因。[6]  

结果分析显示，MIR137–/–小型猪大脑中DEGs与神经发育和突触形成相关。疾病关联性分析显示，这些DEGs中包括大量与ID和癫痫相关的基因，与人类ASD病人脑组织转录组数据高度一致，而在小鼠模型中却从未发现。跨物种比较分析显示，与MIR137–/–小鼠相比，MIR137–/–小型猪展现出更多关键神经元基因、ASD和ID风险基因的变化，这与MIR137–/– hiPSC-derived neuron的转录组分析结果更一致性。并且在MIR137–/–小型猪大脑中，与认知损伤和NDD相关的CAMK2A等人类特异性miR-137靶基因显著上调。这些结果表明，小型猪中miR-137的缺失影响了神经发育相关基因的表达，可能促进了NDD的发生发展。遗憾的是，纯合敲除的MIR137–/–小型猪模型出生后致死，未来研究人员将尝试利用单sgRNA和dCAS9/CRISPR系统获取杂合的MIR137+/–小型猪模型，并综合评估其在与NDD核心临床症状相关的行为分析中的表现。  

 
研究结论    

综上所述，本研究在小型猪模型中证明了MIR137缺失对神经发育及相关疾病的影响，明确了小型猪可作为神经发育障碍的新型动物模型，为其在人类神经发育障碍疾病研究中的潜在应用提供理论依据。   
    
参考文献：  [1]Thapar, A., Cooper, M. & Rutter, M. Neurodevelopmental disorders. Lancet Psychiatry 4, 339-246, doi:10.1016/s2215-0366(16)30376-5 (2017). [2]Abrahams, B. S. & Geschwind, D. H. Advances in autism genetics: on the threshold of a new neurobiology. Nature Reviews Genetics 9, 341-355, doi:10.1038/nrg2346 (2008). [3]Hermann, B. P. et al. Neurobehavioural comorbidities of epilepsy: towards a network-based precision taxonomy. Nature Reviews Neurology 17, 731-746, doi:10.1038/s41582-021-00555-z (2021). [4]Li, Z., Zhu, Y. X., Gu, L. J. & Cheng, Y. Understanding autism spectrum disorders with animal models: applications, insights, and perspectives. Zoological Research 42, 800-824, doi:10.24272/j.issn.2095-8137.2021.251 (2021). [5]Batkai, S. et al. CDR132L improves systolic and diastolic function in a large animal model of chronic heart failure. Eur. Heart J. 42, 192-201, doi:10.1093/eurheartj/ehaa791 (2021). [6]Xu, S., Wang, J., Mao, K. et al. Generation and transcriptomic characterization of MIR137 knockout miniature pig model for neurodevelopmental disorders. Cell Biosci 14, 86 (2024). https://doi.org/10.1186/s13578-024-01268-8