Nature protocols
nextPYP：基于单颗粒冷冻电镜断层扫描的原位结构测定与构象分析
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本文介绍了一款基于网络的nextPYP应用程序，该程序通过单颗粒冷冻电镜断层扫描（SP-CET）实现高分辨率原位结构测定和构象异质性分析。nextPYP具备用户友好性、存储和计算效率高，可将结构测定时间从数月缩短至数天，适用于原位结构测定及构象分析。
文献概述
本文《In situ structure determination of conformationally flexible targets using nextPYP》，发表于《Nature Protocols》杂志，回顾并总结了单颗粒冷冻电镜断层扫描（SP-CET）技术在原位结构测定中的应用及nextPYP在该流程中的作用。文章详细描述了从原始倾斜系列数据到3D结构生成的完整流程，包括运动校正、数据重建、粒子挑选、高分辨率精修和3D分类。整段通顺、有逻辑，适用于科研工作者在结构生物学、药物研发和生物医学成像领域。
背景知识
SP-CET技术是近年来结构生物学研究的重要手段，可解析蛋白质在细胞环境中的分布、相互作用及构象变化。传统单颗粒分析（SPA）方法在原位结构解析中受限，尤其是基于原子模型的模板匹配技术。nextPYP基于约束单颗粒断层扫描（CSPT）原理，采用2D粒子投影而非3D子断层扫描进行图像对齐，提高了分辨率和效率，同时减少了存储需求。nextPYP支持多种粒子挑选策略，包括基于尺寸、几何、神经网络的自动挑选，以及手动编辑功能。该方法特别适用于高通量、低浓度蛋白结构的原位研究，如病毒颗粒、核糖体及膜结合蛋白等。
研究方法与实验
nextPYP的完整流程包括项目创建、数据导入、预处理（包括电影帧对齐、倾斜系列对齐、CTF估计、断层图重建）、粒子挑选（包括基于尺寸、几何、神经网络和手动挑选）、3D精修与重建（支持参考序列和从头精修）、粒子过滤、3D分类、掩膜生成、区域精修、CTF精修、运动校正等步骤。整个流程通过网页界面操作，无需编程经验，同时支持数据导入导出功能，如IMOD模型文件和STAR格式。流程设计注重自动化和可重复性，通过预定义工作流和在线教程提升用户体验。
关键结论与观点
研究意义与展望
nextPYP的推出为结构生物学提供了一站式解决方案，尤其适用于原位结构测定和构象分析。该工具简化了数据处理流程，降低了高通量冷冻断层扫描分析的门槛，使得非专业用户也能完成高质量结构重建。未来，nextPYP有望在更广泛的生物大分子研究中发挥重要作用，如膜蛋白、病毒颗粒及多蛋白复合物的高分辨率结构解析。随着自动化与人工智能的进一步整合，该平台还可扩展至更高通量、更高精度的结构分析领域。
结语
本文介绍的nextPYP是一款高效的单颗粒冷冻电镜断层扫描结构解析工具，特别适用于原位蛋白结构研究。通过优化图像处理流程、提高数据处理效率和减少人工干预，该工具为结构生物学家提供了便捷、可重复的工作流，并支持多种粒子挑选与精修策略。nextPYP的发布不仅推动了冷冻电镜断层扫描技术的普及，也为高分辨率结构研究和构象异质性分析提供了新的可能性。对于科研工作者而言，该平台降低了原位结构测定的难度，提高了实验成功率，是结构解析领域的重要进展。
