肝纤维化的治疗新策略：一种新型的CAR-巨噬细胞疗法

肝纤维化是多种肝病共同的病理过程，是从慢性肝损伤进展到肝硬化甚至肝癌的关键环节，其主要特征包括肝星状细胞（Hepatic stellate cells, HSCs）的激活、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的异常沉积等。在正常肝脏中，ECM是一个高度动态的基质，在合成和降解之间具有精确调节的平衡。然而，当肝脏持续暴露于病毒感染、酒精、代谢紊乱、免疫性炎症以及肝毒性药物等多种致病因素环境下，肝组织发生损伤，大量的肝星状细胞被激活，导致ECM的组成发生变化，肝脏的架构被广泛破坏，若不及时治疗，最终可导致肝硬化和肝衰竭。各种病因导致的肝纤维化严重威胁患者健康，给公共卫生系统带来巨大负担，临床上至今并没有一种较为理想的药物被批准用于治疗肝纤维化。

 

近日，华南师范大学马晓冬/张帅帅研究团队联合澳门大学程红伟研究员团队在Military Medical Research(IF=22.9)杂志上发表题为“TNC-targeted CAR-macrophage therapy alleviates liver fibrosis in mice”。 该团队首次建立了TNC靶向的嵌合抗原受体修饰的巨噬细胞（CAR-Ms），其有效减轻肝脏的纤维化。

 

该研究通过分析公共数据来源的临床和小鼠样本资源库，发现TNC在肝纤维化组织中高表达，并在肝星状细胞（HSCs）中呈现特异性高表达，随后在TNC基因敲除鼠和四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化小鼠模型中验证了TNC在肝纤维化中的作用。研究通过设计一种靶向TNC的单链可变区片段（scFv），用于生成TNC靶向的CAR-Ms并评估其生物学功能，并通过蛋白免疫印迹、流式细胞术和RNA测序等阐明了TNC靶向CAR-Ms治疗肝纤维化的潜在机制，为肝纤维化的巨噬细胞治疗策略开发提供了重要的理论基础和实验依据。

 

 

研究材料和技术方法

采用TNC基因敲除小鼠（其中TNC-KO小鼠由赛业生物提供）和同窝对照小鼠，研究TNC在肝纤维化中的作用。设计了tnc靶向单链可变片段（scFv）来生成TNC-CAR-Ms并评估其生物学功能。在体外测试TNC-CAR-Ms的吞噬和杀伤作用，在体内评估TNC-CAR-Ms的抗纤维化功效和安全性。通过Western blotting、流式细胞术和RNA测序研究了TNC-CAR-Ms治疗肝纤维化的潜在机制。

 

技术路线

1. 构建 TNC-CAR 载体  

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2. 转染巨噬细胞（得到 TNC-CAR-M）  

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3. 体外验证吞噬与杀伤 HSC 能力  

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4. 注射 TNC-CAR-M 至肝纤维化小鼠  

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5. 评估抗纤维化效果与免疫机制（病理 + 分子检测）

 

研究结果

研究人员首先研究了TNC在不同肝纤维化分期临床患者中的表达。结果显示，与正常对照组织相比，大多数纤维化组织中TNC表达增加（图1a）。晚期纤维化患者的TNC表达明显高于早期纤维化患者（图1a， b）。我们对肝硬化患者和无纤维化患者的肝组织样本进行免疫组化分析，也证实了TNC蛋白在纤维化患者中的表达增加（图1c）。生存分析显示，TNC高表达与肝硬化患者较短的总生存期相关（图1d）。相关分析进一步揭示了TNC表达与转化生长因子-β (tgf -β 2)表达之间的强正相关（R > 0.30, P < 0.001），表明TNC在纤维化进展中的潜在纤维化功能（图1e）。

 

图1 TNC在不同肝纤维化分期临床患者中的表达

 

接下来，研究人员研究了TNC在肝纤维化小鼠模型中的表达。CCl4是一种有效的肝毒素，已被广泛用于化学诱导的小鼠肝纤维化。在公共基因表达Omnibus数据库中，我们首次发现，在ccl4诱导纤维化小鼠的肝组织中，Tnc基因的表达显著增加（图2a）。此外，编码tenascin- w （Tnn）、tenascin- r （Tnr）和tenascin- x （Tnxb）的基因（tenascin家族的其他成员）的表达没有明显变化（图2a）。先前的证据表明，整合素αvβ3、αvβ6、α2β1、α7β1、α8β1和α9β1等多种整合素可能是TNC受体[31]。通过生物信息学分析，我们还观察到大多数编码TNC受体的基因，如Itgav、Itga2、Itga8、Itga9、Itgb1和Itgb6，在纤维化小鼠的肝组织中表达上调，但不包括Itga7和Itgb3（图2b）。

 

然后使用CCl4在Tnc KO小鼠及其WT幼崽中诱导肝纤维化，以研究Tnc在肝纤维化中的潜在作用（图3a）。实验结束时，各组小鼠的体重相似（图2c）。然而，与WT小鼠相比，注射CCl4后6周，Tnc KO小鼠的血清谷丙转氨酶（ALT）水平、天冬氨酸转氨酶（AST）水平、肝脏形态以及苏木精和伊红（H&E）染色的评估表明，Tnc KO小鼠的肝损伤明显减轻（图3b, c；图2d）。更重要的是，Sirius Red染色、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫组化和羟脯氨酸检测显示Tnc KO小鼠肝脏中胶原沉积减少（图3c, d）。注射CCl4后6周，Tnc KO小鼠血清白蛋白水平显著升高，表明肝损伤减轻（图3e）。酶联免疫吸附法检测血清il - 1β水平也显示，注射CCl4后6周，Tnc KO小鼠的炎症减轻（图3f）。这些观察结果得到了RT-qPCR分析的支持，该分析显示Tnc KO小鼠肝脏中促炎因子（Tnfα， il - 1β和Cxcl1）和纤维化基因（Acta2， Col1a1和Col2a1）的表达下调（图3g）。注射CCl4 6周后，WT小鼠肝脏TNC蛋白表达水平升高，TLR4、p-NF-κB、整合素αV和p-FAK蛋白表达水平显著升高，表明TLR4/核因子κ b （NF-κB）和整合素/局灶黏附激酶（FAK）两种参与炎症和纤维化的经典信号通路活性上调（图S2e）。有趣的是，与WT小鼠相比，Tnc KO小鼠表现出Tnc表达的大幅下降，同时TLR4、p-NF-κB、整合素αV和p-FAK蛋白的表达水平下降，表明TLR4/NF-κB和整合素/FAK通路活性下调（图S2e）。总的来说，这些发现表明TNC可能有助于肝纤维化，并可作为潜在的治疗靶点。

 

图2 TNC在肝纤维化小鼠模型中的表达

 

图3 Tnc在肝纤维化中的潜在作用

 

总结

该研究首次构建靶向 TNC 的 CAR-Ms，有效减轻肝纤维化。研究先通过临床和小鼠样本发现 TNC 在肝纤维化组织及 HSCs 中高表达，经基因敲除鼠和 CCl4 诱导模型验证其作用，再设计靶向 TNC 的 scFv 生成 CAR-Ms，借助多种技术阐明其治疗机制，为相关巨噬细胞治疗策略提供理论与实验支撑。

 

补充说明

Chen, KZ., Lin, ZY., Chen, LJ. et al. TNC-targeted CAR-macrophage therapy alleviates liver fibrosis in mice. Military Med Res 12, 78 (2025). https://doi.org/10.1186/s40779-025-00667-3