陆军军医大学研究团队揭示FBXO32介导D型细胞周期蛋白发生非降解形式的泛素化修饰从而驱动肿瘤进展
细胞周期调节的失控是导致肿瘤细胞持续增殖的关键因素。细胞周期蛋白D1（cyclin D1）作为细胞周期的重要调控分子，在促进包含肝癌在内的多种恶性肿瘤增殖中具有重要作用。 Cyclin D1通常与细胞周期蛋白依赖激酶4/6（cyclin dependent kinase 4/6, CDK4/6）直接结合，促进CDK4/6对其下游底物RB蛋白的磷酸化，进一步释放E2F并诱导其向细胞核转位，增强细胞周期调控相关基因的转录，最终促进细胞增殖。Cyclin D1作为周期蛋白，其蛋白水平随着细胞周期进程改变而呈现波动性、周期性变化，其半衰期较短（约30 min）。目前普遍认为，泛素-蛋白酶体降解途径在调节cyclin D1蛋白周期性变化中发挥重要作用。既往研究表明，cyclin D1的泛素化降解主要受Cullin1-RING 泛素连接酶家族（CRL）成员（FBXO4，FBXO31，β-TrCP，FBXW8, SKP2, FBXL2及FBXL8）和细胞周期后期促进复合体（anaphase-promoting complex/cyclosome, APC/C）泛素连接酶的调节。
除此之外，2021年Nature杂志同期发表三篇文献，揭示泛素连接酶AMBRA1在促进cyclin D蛋白泛素化降解中的重要作用。新近研究报道，MG53（TRIM72）可通过促进cyclin D1蛋白泛素化降解从而抑制肿瘤生长。以上研究表明泛素化修饰在促进cyclin D1降解（即cyclin D1降解形式的泛素化修饰）中具有重要作用。泛素化修饰除了可促进底物蛋白的降解（降解形式的泛素化修饰）外，还可调节底物蛋白的稳定性、活性、亚细胞定位以及蛋白-蛋白相互作用（即非降解形式的泛素化修饰）。但截至目前，非降解形式的泛素化修饰（non-degradative form of ubiquitination）在调节cyclin D1功能中的作用，尚不十分清楚，亟待阐明。
2025年4月30日，陆军军医大学研究团队在Nature Communications杂志上发表了题为“F-box protein FBXO32 ubiquitinates and stabilizes D-type cyclins to drive cancer progression”的研究论文。该研究发现E3泛素连接酶FBXO32可通过促进D 型细胞周期蛋白泛素化修饰从而增强其稳定性，首次揭示了cyclin D蛋白非降解形式的泛素化修饰并解析了具体的分子机制，抑制FBXO32-cyclin D1信号轴可显著增强CDK4/6 抑制剂对肿瘤细胞的杀伤效应。该论文的通讯作者为陆军军医大学第一附属医院熊浩君教授，张雷达教授，谢传明教授和陆军军医大学基础医学院何凤田教授，第一作者为陆军军医大学-重庆医科大学联合培养李封博士、陆军军医大学第一附属医院余鸿强助理研究员和张玉君高级实验师。
图片来源：《Nature Communications》
研究材料
在这项研究中，研究人员利用原发性肝癌小鼠模型和胰腺癌模型（KPC 转基因小鼠由赛业生物提供，genotype: LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre），揭示了FBXO32在肿瘤进展中的作用。
技术方法
他们在研究中采用了多项技术，包括全外显子组测序分析、Western blotting、蛋白质稳定性分析。在分析cyclin D的结合伴侣时，他们使用了免疫荧光、LC-MS/MS分析、GST pull-down和SPR分析等。
技术路线
- 利用Co-IP联合质谱技术，鉴定cyclin D的潜在结合蛋白
- 证实FBXO32与cyclin D1的直接结合
- 明确FBXO32对cyclin D蛋白及泛素化水平的影响
- 证实FBXO32通过稳定cyclin D驱动肿瘤的进展
研究结果
既往研究表明，cyclin D1 蛋白第286位或288位苏氨酸（T286或T288）的磷酸化修饰在促进其被泛素连接酶识别及泛素化降解中具有重要作用，突变cyclin D1 T286或T288位点可显著抑制其与泛素连接酶的结合及其泛素化降解。为了探索非磷酸化形式的cyclin D1能否发生泛素化修饰，我们将cyclin D1 蛋白第286位或288位苏氨酸突变为丙氨酸（即cyclin D1T286A或cyclin D1T288A）从而模拟cyclin D1去磷酸化状态。非常有趣的是，我们发现非磷酸化状态的cyclin D1T286A和cyclin D1T288A仍保持较高水平的泛素化修饰，提示存在调控cyclin D1蛋白非降解形式的泛素化修饰的泛素连接酶。免疫沉淀联合质谱技术发现，FBXO32可能是介导cyclin D1T286A和cyclin D1T288A泛素化修饰的潜在泛素连接酶。Co-IP实验、免疫荧光实验提示，FBXO32可与cyclin D1相互作用。GST-pull down和SPR实验表明FBXO32可与cyclin D1直接结合。
a将HA-cyclin D1（或HA-cyclin D1T286A、HA-cyclin D1T286A）和His-Ub共转染HEK293细胞48h，取出进行泛素化实验。b质谱鉴定互作蛋白流程图：质谱鉴定能同时与cyclin D1T286A和cyclin D1T288A结合的E3泛素连接酶。C，d免疫沉淀（Co-IP）及Western blot实验检测FBXO32与cyclin D1的结合情况以及FBXO32对cyclin D1蛋白水平的影响；e 免疫荧光实验检测FBXO32和cyclin D1的共定位情况。F GST-pull down实验检测GST-FBXO32和HA-cyclin D1在体外的结合情况；g 体外表达并纯化FBXO32和cyclin D1蛋白，SPR实验检测二者之间的结合情况。
免疫沉淀联合质谱技术发现，FBXO32可能是介导cyclin D1T286A和cyclin D1T288A泛素化修饰的潜在泛素连接酶。我们进一步发现，FBXO32可与cyclin D1相互作用并显著上调cyclin D1的泛素化及蛋白水平，显著增强cyclin D1蛋白稳定性。
a将Flag-FBXO32质粒和阴性对照转染Huh7和CFPAC-1细胞48 h， western blot检测cyclin D1蛋白水平。b用fbxo32特异性shRNA或阴性对照（sh-NC）转染Huh7和CFPAC-1细胞48小时，western blot测定cyclin D1蛋白水平。c 泛素化实验检测Flag-FBXO32或FBXO32ΔF对HA-cyclin D1蛋白泛素化水平的影响。d，e western blot检测FBXO32对内源性cyclin D1蛋白稳定性的影响。f western blot检测FBXO32对外源性HA-cyclin D1蛋白稳定性的影响。
进一步通过免疫沉淀联合质谱技术，鉴定cyclinD1蛋白的潜在泛素化位点，构建cyclin D1不同位点的突变体，证实FBXO32通过促进cyclin D1 K58位点的泛素化修饰从而增强其蛋白稳定性。
a 质谱鉴定cyclin D1泛素化位点的流程示意图。b 质谱鉴定到cyclin D1 K58位点为潜在的泛素化位点。c 泛素化实验检测FBXO32介导cyclin D1泛素化修饰的具体氨酸位点。d Western bot检测突变cyclin D1 K58位点对cyclin D1蛋白水平的影响。e，f Western bot检测FBXO32对外源性HA-cyclin D1或HA-cyclin D1K58R蛋白稳定性的影响。
最后，通过动物实验，验证FBXO32-cyclin D信号轴在肿瘤进展中的作用。研究人员利用原发性肝癌小鼠模型和胰腺癌模型（KPC 转基因小鼠由赛业生物提供，genotype: LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre），证实抑制FBXO32可削弱肿瘤的进展。
总结
D 型细胞周期蛋白的三个异构体（细胞周期蛋白 D1、D2 和 D3）在结构和功能上具有高度相似性，在通过调节 G1/S 细胞周期转换来定义细胞周期退出和进展方面发挥着关键作用。除了调节细胞周期外，细胞周期蛋白D还具有更广泛的促肿瘤作用。细胞周期蛋白D 在将细胞外刺激信号传递给下游效应器以发挥不同细胞功能方面发挥着关键作用。鉴于细胞周期蛋白 D 在细胞周期和癌症进展调控中的重要性，对细胞周期蛋白 D 调控机制的更深入理解将为如何阻断癌症发展中的细胞周期进程及相关过程提供关键信息。这项研究表明，E3泛素连接酶可以和cyclin D1直接结合从而诱导其K58位点发生多聚泛素化修饰，增强cyclin D1蛋白稳定性，促进细胞周期G1/S期转换，最终导致肝胆胰肿瘤的进展。此外，FBXO32对cyclin D2和cyclin D3也有类似的影响。研究人员发现癌细胞操纵细胞周期从而加速肿瘤生长的分子机制，即FBXO32通过泛素化修饰稳定D型细胞周期蛋白从而促进肿瘤细胞增殖。该工作不仅拓宽了我们对健康细胞和癌细胞的细胞周期控制的理解，而且为靶向癌症治疗开辟了新的途径。
补充说明
Feng Li, Hongqiang Yu, Yujun Zhang，et al, F-box protein FBXO32 ubiquitinates and stabilizes D-type cyclins to drive cancer progression. Nat Commun. 2025 Apr 30;16(1):4060. doi: 10.1038/s41467-025-59407-9.
