Circulation：新研究发现HEG1在动脉粥样硬化中发挥保护作用
动脉粥样硬化作为心血管疾病的病理基础，其发病具有明显的部位偏好性，优先发生在血管分支和弯曲区域，这些区域暴露在紊乱血流模式（d-flow）中。相比之下，直行、无分支的血管区域因受到稳定血流（s-flow）作用，不易形成动脉粥样硬化。
s-flow向内皮细胞表面传递单向层流剪切应力（ULS），促进内皮细胞稳态，诱导抗动脉粥样硬化的重编程反应；而d-flow产生的振荡性低幅剪切应力（OSS）则会引发炎症反应、血管通透性增加、细胞凋亡等促动脉粥样硬化改变。内皮细胞在不同血流模式下的改变主要通过血流敏感基因的转录变化来实现。因此，鉴定这些血流敏感基因的功能特征，对于了解动脉粥样硬化形成的分子机制以及发现治疗靶点具有重要意义。
HEG1是一种单次跨膜的黏蛋白样糖蛋白，在内皮细胞中高表达。以往研究发现，敲除小鼠和斑马鱼中的heg1会导致胚胎致死，原因是心脏和血管发育严重紊乱。不过，在成年动物血管内皮细胞中，HEG1在血流应答和动脉粥样硬化形成中的作用尚未明确。
佐治亚理工学院和埃默里大学的研究人员发现，HEG1在s-flow下表达升高，在d-flow下表达下降，并通过KLF2/4依赖性的方式介导s-flow诱导的抗动脉粥样硬化反应。这项研究成果发表在《Circulation》杂志上，表明HEG1- KLF2/4轴是动脉粥样硬化的潜在治疗靶点。
研究材料与方法
研究人员重新分析了小鼠部分颈动脉结扎术（PCL）模型的单细胞RNA测序数据，通过免疫染色、定量PCR反应等技术检测了小鼠动脉、人主动脉内皮细胞（HAEC）和人类冠状动脉中的HEG1表达。他们利用siRNA敲降HEG1，在不同血流条件下研究其在HAEC中的功能以及信号传导机制。他们还利用HEG1fl/+小鼠（由赛业生物提供）构建了他莫昔芬诱导型、内皮细胞特异性的HEG1基因敲除小鼠（HEG1iECKO），并建立急性（PCL手术）和慢性（西方饮食）动脉粥样硬化模型，观察不同性别小鼠不同动脉部位的斑块形成情况。
技术路线
重新分析小鼠PCL模型的单细胞RNA-seq数据，确定HEG1为血流敏感基因
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利用免疫染色等技术，在体内外实验中评估HEG1的表达及其亚细胞定位
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利用siRNA敲降等技术，在不同血流条件下研究HEG1的分子作用机制
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利用HEG1iECKO小鼠构建急性和慢性动脉粥样硬化模型，以确定HEG1在斑块形成中的作用
研究结果
血流控制HEG1表达及亚细胞定位
研究人员之前通过PCL手术构建了小鼠急性动脉粥样硬化模型，并将左侧颈总动脉暴露于d-flow，而右侧颈总动脉暴露于s-flow作为对照。此次重新分析单细胞RNA-seq数据后，他们确定Heg1为血流敏感基因，主要在内皮细胞中表达。与暴露于d-flow的内皮细胞相比，s-flow条件下的内皮细胞表达更高水平的Heg1，这表明内皮细胞中的Heg1表达具有血流敏感性，s-flow可上调Heg1表达，而d-flow下调Heg1表达。
为了验证体内实验的结果，他们将人主动脉内皮细胞（HAEC）暴露于ULS（模拟s-flow）或OSS（模拟d-flow）中，并设置静态（无血流）条件作为对照。与OSS和静态条件相比，在暴露于ULS 24小时后，HEG1 mRNA和蛋白表达显著增加（图1）。令人惊讶的是，经过ULS处理的HAEC培养上清液也检测到HEG1蛋白。利用免疫荧光显微镜观察HEG1表达后，他们惊讶地发现ULS条件下的HEG1染色呈现出向内皮细胞下游定位的特征（图1）。这些结果表明，血流不仅能调控HEG1基因和蛋白表达，还能调控HEG1蛋白的极化定位及其向培养基中的释放。
图1. ULS诱导HEG1 mRNA和蛋白表达，并刺激蛋白分泌到培养基中
在证实HEG1是血流敏感基因后，研究人员在血流条件下对HAEC进行siRNA敲降实验，以验证其功能意义。与预期一致，ULS抑制了HAEC的单核细胞粘附、通透性和迁移反应，而HEG1敲降可逆转这些抑制作用。此外，HEG1敲降还阻断了ULS介导的VCAM1抑制和eNOS诱导。这些结果表明，在s-flow诱导的内皮功能调控中，HEG1发挥了关键作用。
HEG1的分子作用机制
接下来，研究人员深入探究了HEG1介导s-flow作用的分子机制。他们假设HEG1调控两种关键的s-flow诱导转录因子（KLF2/4）的表达。为了验证这一假设，他们在经过siHEG1和ULS处理的HAEC中检测KLF2/4 mRNA和蛋白表达。正如预期，ULS显著诱导KLF2/4表达，而HEG1敲降则抑制该效应，表明HEG1调控了ULS诱导的KLF2/4表达。
ULS通过激活内皮细胞中的MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2通路调控KLF2/4表达，但上游激活机制仍不清楚。研究人员发现，ULS可增强ERK5磷酸化，而HEG1敲降则削弱该效应，为HEG1调控ERK5提供了关键证据。基于一系列抑制剂的实验表明，HEG1是ULS诱导的MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2通路的上游调控因子。
那么，HEG1如何调控MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2通路？KRIT1是MEKK3激活的抑制因子，但它是否调控血流诱导的MEKK3-KLF2/4通路仍然不明确。利用siRNA敲降KRIT1后，研究人员发现ULS诱导的ERK5磷酸化和KLF2/4表达显著增强，证实KRIT1在MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2通路的血流激活中发挥抑制作用。有意思的是，尽管ULS可增加KRIT1 mRNA表达，但细胞裂解液中的KRIT1蛋白水平却下降。
考虑到KRIT1可与HEG1结合，而之前的实验表明ULS可诱导HEG1蛋白释放到培养基中，那么KRIT1蛋白是否与HEG1共同释放？他们惊讶地发现，KRIT1在ULS条件下也被释放到培养基中，而HEG1敲降可阻止KRIT1的释放。这些结果表明，KRIT1的释放依赖于HEG1。免疫共沉淀实验证实了这个结论，无论剪切条件如何，两者的结合状态都保持稳定。至此，他们提出了一种有趣的假设：ULS促进内皮细胞将HEG1和KRIT1（MEKK3抑制剂）释放到培养基中，进而激活MEKK3-MEK5-ERK5-KLF2/4通路，诱导KLF2/4表达。
HEG1敲除加剧动脉粥样硬化
为了测试内皮细胞靶向的HEG1缺失对小鼠动脉粥样硬化发展的影响，研究人员利用HEG1fl/+小鼠（由赛业生物提供）构建了他莫昔芬诱导型、内皮细胞特异性的HEG1基因敲除小鼠（HEG1iECKO）。在急性PCL模型中，HEG1iECKO小鼠的颈动脉斑块面积增加40%，斑块内坏死核心面积扩大、巨噬细胞浸润增加，并伴随着纤维帽变薄和斑块内出血等特征（图3）。
图2. 内皮细胞特异性的HEG1敲除刺激晚期动脉粥样硬化斑块的形成
在西方饮食诱导动脉粥样硬化模型中，HEG1iECKO小鼠的斑块数量显著高于HEG1WT小鼠，且呈现性别和主动脉部位依赖性。与HEG1WT小鼠相比，HEG1iECKO小鼠主动脉弓的斑块数量在雌雄小鼠中均显著增加，而降主动脉和主动脉窦区域的斑块形成则表现为雄性特异性增加，这表明内皮细胞HEG1缺失的促动脉粥样硬化效应具有主动脉部位和性别依赖性。
最后，研究人员检测了HEG1表达水平与人类冠状动脉中动脉粥样硬化斑块的严重程度是否相关。他们在未病变（I–II级）的冠状动脉内皮细胞中观察到丰富的HEG1表达，而在晚期病变（III-IV级及V-VI级）的内皮细胞中，HEG1蛋白表达显著降低（图3）。这些结果表明HEG1表达与人类冠状动脉中晚期动脉粥样硬化发展相关，凸显了HEG1表达的临床意义。
图3. HEG1表达在伴有晚期斑块的人类冠状动脉中显著降低
结论
总的来说，这项研究表明HEG1是一种新型的抗动脉粥样硬化的血流敏感蛋白，其通过与KRIT1相互作用调控MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2-KLF2/4通路，维持内皮细胞稳态，抑制动脉粥样硬化的发展（图3）。这条血流依赖性的HEG1-KRIT-MEKK3-MEK5-ERK5-MEF2-KLF2/4通路为抗动脉粥样硬化疗法的开发提供了全新靶点。
原文检索
Tamargo IA, Baek KI, et al. HEG1 Protects Against Atherosclerosis by Regulating Stable Flow-Induced KLF2/4 Expression in Endothelial Cells. Circulation. 2024 Apr 9;149(15):1183-1201. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.123.064735.
