Blood（IF=23.1）封面文章：血小板参与血栓炎症反应的新机制

NLRP6^flox/flox小鼠（由赛业生物提供）、PF4-CRE小鼠和野生型小鼠

流式细胞术、动脉血栓模型，脓毒症模型、出血模型、蛋白印迹、蛋白质谱分析、免疫荧光等。

为探索NLRP6是否在血小板内表达，研究人员检测了人和小鼠血小板内NLRP6的表达，证实NLRP6在血小板内表达（图1）。为进一步研究其在血栓炎症反应中的作用，研究人员构建了血小板特异性NLRP6敲基因小鼠（由赛业生物提供）。利用脓毒症血栓炎症模型，发现血小板NLRP6缺失显著降低脓毒症小鼠生存期并增加肺和肝脏微血栓形成。

图1 血小板NLRP6在脓毒症生存期和微血栓形成中的作用^[1]

为探索NLRP6对脓毒症中血小板活性的影响，研究者分离不同时间点脓毒症小鼠的血小板，检测了血小板的活化及血小板与中性粒细胞结合，发现NLRP6缺失显著增强血小板活化（P-selectin表达）和血小板与中性粒细胞结合。此外，免疫荧光发现NLRP6缺失显著促进中性粒细胞向肺脏的聚集、血小板与中性粒细胞结合及中性粒细胞胞外诱捕网的形成（图2）。

图2 NLRP6敲除显著促进脓毒症中血小板和中性粒细胞的活化及NETs形成^[1]

进一步血小板功能分析发现，NLRP6缺失显著增加了体外血小板的聚集能力、颗粒释放、活化、钙动员及促凝活性，同时参与体内止血和动脉血栓形成能力也显著增强（图3）。

图3 NLRP6对血小板功能的影响^[1]

为进一步探索NLRP6对血小板信号通路的影响，研究者检测了NF-kB的活化发现NLRP6敲除血小板在刺激后NF-kB信号通路显著增强，而抑制NF-kB活化后则可显著降低NLRP6敲除血小板的高反应性，提示NLRP6可能通过影响NF-kB信号通路调控血小板功能（图4）。

图4 NLRP6敲除后对血小板NF-kB信号通路的影响^[1]

为进一步探索NLRP6调控NF-kB信号通路的机制，研究人员首先检测了TABs复合物的表达，发现NLRP6敲除血小板在活化后TAB1的表达量并未有所改变，而正常血小板活化后TAB1的表达量显著降低，提示NLRP6可能影响血小板活化后TAB1的表达。进一步分析发现，NLRP6调控TAB1发生泛素化修饰和降解。利用IP-MS方法，研究人员鉴定了TRIM21是介导TAB1发生泛素化修饰的主要E3连接酶，而NLRP6在两者之间起“桥梁”作用（图5）。

图5 NLRP6介导TRIM21与TAB1结合引起TAB1泛素化修饰和降解^[1]

为验证NLRP6敲除后引起的脓毒症严重程度的加剧是否由NF-kB信号通路所引起，研究人员使用了NF-kB信号通路抑制剂。结果发现，抑制NF-kB信号通路显著抑制了脓毒症中NLRP6敲除血小板的活化、中性粒细胞的募集、NETs和微血栓形成及显著提高了生存率（图6）。

图6 抑制NF-kB信号通路减轻脓毒症中血小板活化和微血栓形成^[1]

最后，研究人员探讨了脓毒症血浆对血小板NLRP6-TRIM21-TAB1轴的影响，发现脓毒症血浆可诱导血小板p65磷酸化，TAB1蛋白降解、和NLRP6/TRIM21/TAB1的相互作用。此外，抑制TLR4或 MyD88预处理可阻断上述效应，表明脓毒症血浆通过TLR4/MyD88信号激活血小板NLRP6-TRIM21复合体，动态调控TAB1降解以限制NF-κB过度活化。

图7 血小板NLRP6在脓毒症微血栓形成和血栓炎症中发挥保护作用^[1]

本研究利用巨核细胞/血小板特异性NLRP6敲基因小鼠及IP-MS等方法，发现血小板NLRP6在脓毒症微血栓形成和血栓炎症中发挥保护作用，提示NLRP6可能是预防血栓炎症性疾病的潜在治疗靶点。