肿瘤免疫治疗新靶点-武汉大学研究团队揭示DUSP18调控结直肠癌免疫逃逸的分子机制

结直肠癌（CRC）是全球发病率第三高、致死率第二高的恶性肿瘤。目前，仅有15%的CRC患者能够从免疫检查点阻断（ICB）治疗中获益。一个重要原因在于肿瘤细胞对其新陈代谢进行重编程以产生专门的代谢物，这些代谢物既能促进自身的生长，又能促进肿瘤免疫逃避，即肿瘤以促进浸润CD8+ T细胞耗竭和失活的方式重塑其微环境，从而导致“免疫逃逸”的发生。然而，这些功能之间的关系尚不清楚。

2024年7月，武汉大学生命科学学院李友军教授团队在国际主流学术期刊《Nature communications》在线发表了题为“Inhibition of DUSP18 impairs cholesterol biosynthesis and promotes anti-tumor immunity in colorectal cancer”的研究论文。武汉大学生命科学学院李友军教授为该论文的通讯作者，生命科学学院博士研究生周小军为该论文的第一作者。武汉大学生命科学学院与医学研究院为该研究提供了技术和平台支持。

该研究结直肠癌免疫逃逸这一现象为切入点，揭示了DUSP18作为新的调控胆固醇生物合成的因子，来促进肿瘤微环境中羊毛甾醇的积累进而限制T细胞的活化，最终促进CRC的免疫逃逸。

研究材料
在这项研究中，研究人员构建了肠上皮细胞Dusp18条件性敲除小鼠模型（其中Dusp18条件性敲除小鼠模型由赛业生物提供）。体外研究则采用了Dusp18-KD的MC38和HCT116的细胞系

技术方法
研究人员采用了多种技术，包括CRISPR筛选、小鼠模型、细胞培养、流式细胞术、免疫组化、蛋白质、单细胞分析，转录组学和代谢组学等。

技术路线

研究结果
1.sgRNA文库筛选鉴定DUSP18促进CRC免疫逃逸

研究人员通过sgRNA文库筛选，并寻找与细胞毒性T淋巴细胞（CTL）评分负相关的交集基因，其中最值得注意的是Dusp18。与正常结直肠组织相比，CRC样本中DUSP18 mRNA的表达水平也较高。在DUSP18 mRNA低表达的CRC患者中，CTL评分高的患者生存率更高，而DUSP18 mRNA高表达且CTL评分高的患者生存率更低。为了确定抑制Dusp18是否会影响T细胞介导的抗肿瘤功能，研究人员在MC38 CRC细胞和表达卵清蛋白（OVA）的B16黑色素瘤（B16-OVA）细胞中进行shRNA介导的Dusp18抑制。敲低Dusp18并不影响肿瘤细胞在体外的增殖或肿瘤在免疫缺陷裸鼠体内的生长。然而，抑制Dusp18确实会影响免疫功能正常小鼠中肿瘤生长并延长其生存时间，而清除CD8+ T细胞则可以消除敲低Dusp18引起的肿瘤生长劣势。因此，上述结果表明，DUSP18通过CD8+ T细胞依赖的方式来促进CRC的免疫逃避。

图1 抑制Dusp18表达可增强肿瘤浸润性CD8+T细胞的功能

2.抑制DUSP18会影响胆固醇的生物合成

为了确定抑制DUSP18表达抗肿瘤免疫的分子机制，研究人员对shCtrl和shDusp18 MC38细胞进行RNA-seq分析。GO和KEGG分析显示，shDusp18细胞中下调的基因主要是参与胆固醇生物合成及其下游代谢途径。基因集富集分析（GSEA）也显示，与胆固醇稳态相关的基因在对照细胞中呈正富集。随后通过进一步证实，在shDusp18 MC38细胞和CKO（肠道上皮特异性DUSP18缺失的小鼠）肿瘤组织中（由赛业生物构建的小鼠），胆固醇生物合成基因的mRNA表达和蛋白水平下降。此外，研究人员还对shCtrl和shDUSP18人CRC HCT116细胞进行RNA-seq分析，以验证在小鼠MC38细胞中的结果。GO、KEGG和GSEA分析均显示，抑制DUSP18可显著降低胆固醇生物合成途径相关基因的表达。总之，上述研究结果都支持DUSP18通过调节细胞胆固醇的生物合成来调控肿瘤相关的免疫环境。

图2 抑制Dusp18表达降低胆固醇的生物合成

3.TME中的肿瘤细胞来源的羊毛甾醇促进CD8+T细胞失活

研究人员后续猜想胆固醇生物合成途径中的一种或多种中间产物可能是抑制CD8+T细胞功能的原因。利用胆固醇代谢组学测定MC38肿瘤间质中这些中间产物代谢水平，发现下调幅度最大的是羊毛甾醇（40%）。为了直接确定其相关性，研究人员用羊毛甾醇处理原代CD8+T细胞，结果显示羊毛甾醇以剂量依赖的方式降低CD8+T细胞的活化。据报道，羊毛甾醇可促进HMG-CoA还原酶（HMGCR）的泛素化和蛋白酶体降解，而HMGCR是甲羟戊酸途径中的限速酶。与此一致的是，研究人员发现在小鼠原代CD8+T细胞细胞中，羊毛甾醇处理降低HMGCR蛋白水平，进一步抑制小鼠原代CD8+T细胞中的KRAS蛋白丰度以及ERK和AKT信号传导。这些结果表明，肿瘤来源的羊毛甾醇作为一种免疫抑制代谢物，通过降低HMGCR蛋白水平从而影响KRAS-ERK信号传导来限制CD8+T细胞的细胞毒性功能。

图3 Dusp18驱动的TME中的羊毛甾醇促进CD8+T细胞失活

4.DUSP18 在CRC患者中过表达，可预测免疫荒漠

研究人员还进一步利用CRC临床样本验证了本文发现的信号轴在肿瘤=组织中高度上调，也基于单细胞数据分析发现DUSP18的表达与肿瘤浸润CD8 T细胞功能之间的相关性。

图4 DUSP18 在 CRC 患者中过表达，可预测免疫荒漠

总结
该研究结果揭示了DUSP18在促进免疫逃避中的代谢作用。研究人员发现DUSP18抑制和免疫检查点阻断联合使用可增强CRC小鼠模型中CD8+ T细胞的抗肿瘤活性。这提示了一种潜在的联合治疗形式，在靶向代谢和免疫因子的基础上激活并维持CD8+ T细胞的抗肿瘤活性。

参考文献：
Zhou, X., Wang, G., Tian, C., Du, L., Prochownik, E.V., and Li, Y. (2024). Inhibition of DUSP18 impairs cholesterol biosynthesis and promotes anti-tumor immunity in colorectal cancer. Nature Communications 15, 5851. 10.1038/s41467-024-50138-x.