双带跑不开：常见于目标片段之间的分子量差异较小，如CKO鼠的flox鉴定，3条引物同一体系鉴定。

原因1-电泳问题

凝胶浓度低；电泳时间太短；缓冲液陈旧；电压过高，导致凝胶发热，条带扩散、模糊；电压过低则迁移过慢，条带因长时间扩散而变宽。

解决措施：

• 凝胶浓度：针对分子量差异较小的短片段双带，使用新配的2.5%-3%的TBE胶进行电泳，以提高分辨率；
• 跑胶时间：使用宽胶，适当增加跑胶时间，跑胶过程中使用手提紫外灯观察条带，直至能明显分辨双带；
• 电泳电压：控制在200~320 V，根据实验室电泳槽大小进行调整摸索；
• 电泳缓冲液：勤换电泳缓冲液，避免长时间反复使用后pH漂移、离子强度改变，导致电场不稳定；

原因2-上样量过大，条带宽，重叠在一起；样品纯度差或发生降解

解决措施：减少电泳上样量；产物及时电泳。

原因3-三条引物同一体系时，片段之间的分子量差异过小，导致两条条带不能很好的分离或者亮度不一影响判断

解决措施：当三条引物同一体系，条带1与条带2均＞800bp或条带1和条带2相差＜150bp时，分开两个体系F1/R1和F1/R2扩增。