不同PCR产物在变性退火后，若存在同源序列，可能发生错配杂交，形成异源杂交双链（Heteroduplex）。此类异源杂交双链分子结构松散，与核酸染料的结合效率不均一，在琼脂糖凝胶电泳中迁移速率低于完全配对的同源二聚体，因此通常表现为在目标条带上方额外出现一条或多条条带。

模式动物PCR鉴定中常见于CKO鼠的flox鉴定，不影响目标条带的准确性时可忽略，属于技术上的正常情况，不代表样本有误。

常见于CKO鼠的flox鉴定

解决措施：

• 更换DNA聚合酶：不同DNA聚合酶的保真度/错配率、延伸速度等特性差异会影响PCR产物的“末端结构”和“序列均一性”，从而改变后续变性退火时异源双链的形成效率。使用不同酶扩增同一引物对时，异源双链的条带数量、强弱、位置可能存在差异，这不代表引物或样本有问题，而是酶本身生化特性不同导致的正常现象。
• 优化退火条件（如提高退火温度）：如果希望避免这种额外条带，可以尝试调整退火条件。