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污染出现的原因和解决方法

示例:污染条带,阴性对照、空白对照出现不符合预期的条带,通常会弱于阳性条带

 

污染是 PCR 中非常常见的问题,DNA气溶胶会污染试剂、耗材和 DNA样本,污染物也可能来自之前的扩增反应,打开离心管盖时产生气溶胶,造成手套、移液器、实验桌面、门把手、冰箱以及试剂的污染。

产物越小,污染的可能性越高,常发生于<1000bp短片段反应中,典型表现包括:纯合子鉴定为杂合子,野生型鉴定为突变型,没配过Cre的后代鉴定出Cre阳性,所有本应基因型分离的后代都显示为同一基因型。

 

原因1-体系配制污染

此时阴性对照,空白对照通常均出现污染条带。

解决措施:

  • 重复实验排除单次操作因素;
  • 酶、水、引物等分装使用,定期更换新试剂;
  • 重新合成引物、重设引物、使用特异引物;Cre工具鼠等鉴定尽量避免使用通用引物。

 

原因2-样品污染

包括剪取样本时清洁不当,DNA提取操作时污染,以及模板使用过程中交叉污染。

解决措施:

  • 重新剪取组织样本,每剪完一个样本,剪刀正反面都使用酒精消毒,重新提取DNA样本。

 

原因3-气溶胶污染

污染频率增高,更换试剂、重提样本无法解决。

解决措施:

  • 实验环境的频繁清洁与通风;每次实验前对实验桌面、移液器(过滤枪头)等接触面用酒精、去核酸喷雾进行消毒清洁。

 

原因4-电泳污染

解决措施:

  • 及时更换电泳缓冲液,点样时更换枪头。

 

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