示例：扩增不出条带或者扩增效果差，无条带，条带弱，实验结果重复性不好

 

当基因分型检测出现没有条带或者整体扩增较弱的情况时，问题的根源可能涉及PCR过程的多个环节，包括引物、试剂、DNA模板纯度/浓度、热循环参数以及操作原因。我们建议您按照以下逻辑清晰、步骤明确的流程进行系统性排查：

 

原因1-引物问题

引物错误、漏加、反复冻融降解、设计不佳。

解决措施：

1) 核对序列与订单：确认引物序列正确，并与合成订单信息一致。

2) 检查浓度与加样：确认引物工作液浓度（一般为10 μM），并核实加样量是否充足、有无漏加。

3) 更换备用引物：若怀疑引物降解或设计不佳，应更换备用引物进行测试。

4) 保存与分装：引物稀释后建议分装保存于-20°冰箱，避免因存储条件不当、反复冻融而降解。

 

原因2-DNA模板问题

加样操作、提取质量差、降解失效。

解决措施：

1) DNA加样操作细节

• 加完DNA模板后，逐一检查管底是否每孔均已加样，并确认加样量一致，必要时调整模板的投入量。

 

2) 核查DNA模板

• 核实未发生老鼠混淆的情况，未用错样本。
• 使用新鲜制备的DNA：长期放置或反复冻融会导致DNA模板断裂、开环或降解，建议使用新鲜制备的DNA双链作为模板。
• 核查DNA状态：对于含有毛发等杂质的样本，使用前建议12,000 rpm 离心1–2分钟，使杂质沉淀至管底，取上清液进行后续实验。

 

3) 确认DNA模板质量

• 使用分光光度计（如NanoDrop）检测DNA纯度与浓度。

    【浓度要求】通常建议在 20~100 ng/μL 范围内。

    【纯度要求】A260/A280 比值 ≈ 1.8（接近1.8表示蛋白污染较少），纯度偏离正常范围可尝试稀释或纯化。

• PCR验证模板质量（无仪器条件）：通过内参PCR扩增验证DNA模板质量，设置阳性对照(已知可扩增样本)。

    【内参扩增出清晰、明亮的正确条带】说明DNA模板质量正常；

    【若内参扩增失败，阳性对照扩增正常】说明模板存在问题（如降解或含抑制物），需重新制备DNA；

    【若内参扩增失败，阳性对照扩增失败】需要从其他环节去排查原因。

 

内参引物序列（适用于扩增片段 ≤700 bp 的普通PCR验证）：

物种	引物名称	序列（5´→3´）	产物长度
小鼠	mInternal-F	GCAGAAGAGGACAGATACATTCAT	689 bp
	mInternal-R	CCTACTGAAGAATCTATCCCACAG
大鼠	rInternal-F	CAAACTAACCGTTGTCCCAATCTG	608 bp
	rInternal-R	TGAGAGCTGGGTACAATTAACCT

 

4) 重新提取DNA

• 组织取样大小：宁少勿多，适量最佳。

    【组织取样过少】DNA产量过低，可能无法满足下游检测需求；

    【组织取样过多（如大块组织含毛发、杂质）】裂解不充分、堵塞离心柱、残留PCR抑制剂，导致提取失败。

    【推荐样本量】鼠爪为例，推荐取样长度0.1-0.2cm（鼠龄较大可适当缩短取样长度如0.1 cm），选择少毛部位。若组织较大，可将组织剪成小块或使用液氮研磨后再裂解。

鼠爪样本

 

• 组织样本的采集：取好的组织样本应尽快进行DNA提取，避免室温放置过久。若无法立即提取，建议将组织样本置于冰上或-20°C/-80°C保存，避免反复冻融。
• DNA提取试剂：Proteinase K、挥发性试剂等现配现用，保存得当，避免失效或效率降低；重要试剂做好使用标记；裂解样本时，保证样本完全浸没在裂解试剂中，避免样本裂解不完全。
• DNA提取方式：根据模板来源、扩增片段及实验条件，选择合适的提取方式；

方法	耗时	适用场景
快速裂解	快速提取试剂盒 （Vazyme #P073）	15-30min	DNA质量稳定性差，适合细胞、囊胚或者天龄小的鼠爪样品
粗提	Triton X100裂解法	过夜裂解	批量样本处理，操作简单，价格便宜，DNA纯度低，比较适合1000 bp以内短片段PCR扩增
精提	DNA提取试剂盒 （TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit）	过夜裂解 （吸附柱）	操作相对繁琐，成本相对高昂，DNA纯度高，适合困难序列和长片段PCR扩增
	磁珠法提取	过夜裂解 （核酸提取仪）	操作相对繁琐，成本相对高昂，DNA纯度高，适合困难序列和长片段PCR扩增

 

•  裂解后样本状态判断及优化：若裂解后液体呈凝胶状或粘稠难以吸取，说明DNA浓度较高或含有杂质，建议稀释样本后再进行实验。若裂解后部分组织未完全消化，说明取样过大，裂解液量过少。建议减少取样量，将组织剪成小块后再裂解，或者适当加多裂解液。

 

原因3-扩增体系、程序不合适

目的片段条带过大，扩增酶效率不高，PCR体系、程序不合适等。

解决措施：

1) 排除操作问题

设置空白对照，野生型对照，阳性对照。阳性对照扩增正常，可排除实验操作问题。

• 实验对照:

    【空白对照】以ddH20代替DNA模板进行PCR扩增，用于检测实验体系、操作步骤或实验环境是否存在污染；

    【野生型对照（阴性对照）】通常为背景鼠的基因组DNA，作为确认WT产物大小是否符合理论的重要参考标志；

    【阳性对照】通常为验证过的阳性样本或构建模型的质粒，用于验证 PCR体系、程序、试剂是否正常工作以及监测扩增效率问题。

• 体系配制细节：在冰浴环境下配制PCR反应体系，完成后尽快放入PCR仪中开始反应，以保证PCR扩增效率。

 

2) 优化PCR产物长度

设计备用引物，缩短PCR产物大小（推荐<1 kb，复杂模板≤700 bp），避开复杂序列（高GC、低GC、重复序列）。

 

3) 优化PCR程序

优先使用酶说明书中推荐的PCR程序，根据扩增片段特点进行调试。扩增困难的尝试降落PCR程序（Touch down） 或者梯度测试最优退火温度。

• 核查PCR仪程序按照酶说明书推荐的参数设置，根据扩增片段特点进行调试。

    【预变性/变性时间】确保模板充分变性（尤其GC-rich区域可延长至3-5 min）。

    【延伸时间】根据目的片段长度调整，一般30 s-1 min/kb，长片段需适当延长延伸时间。

    【循环数】35-40个循环（注意非特异性扩增风险）。

• 三步法：

    适用于<1000bp片段：诺唯赞Vazyme-P222(2× Rapid Taq Master Mix)

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	3 min
变性	94℃	30 秒	35 循环
退火	60℃	30 秒
延伸	72℃	35 秒
终延伸	72℃	5 min

 

    适用于>1000bp片段：NEB M0323L

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	3 min
变性	94℃	30 s	35 循环
退火	60℃	30 s
延伸	65℃	50 s/kb
终延伸	65℃	10 min

 

• 降落PCR程序（Touch down）：

    适用于<1000bp片段：诺唯赞Vazyme-P222(2× Rapid Taq Master Mix)

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	3min
变性	94℃	30s	20 x
退火	62℃(-0.3/cycle)	30s
延伸	72℃	35s
变性	94℃	30s	13 x
退火	56℃	30s
延伸	72℃	35s
充分延伸	72℃	10min
	12℃		hold

 

4) 优化扩增体系（PCR酶）

优先使用按照所用酶的说明书推荐体系，确认配制体系时各组分的用量是否正确。总体积有修改的，确认各组分比例不变。不同酶的适用范围差异较大，如果一直扩增失败，考虑正在使用的酶不适用于该片段的鉴定，建议更换酶或添加PCR增强剂（DMSO、甜菜碱、GC buffer等）提升扩增效率。

• PCR酶及体系：

    适用于<1000bp片段：诺唯赞Vazyme-P222(2× Rapid Taq Master Mix)

组分	x1
基因组 DNA	1.5 μL
正向引物 (10 μM)	1 μL
反向引物 (10 μM)	1 μL
酶	12.5 μL
加水至	25 μL

   

    适用于>1000bp片段：NEB M0323L

组分	x1
基因组 DNA	2 μL
正向引物 (10 μM)	2 μL
反向引物 (10 μM)	2 μL
dNTPs (2.5 mM)	6 μL
5X LongAmp Taq Reaction	10 μL
LongAmp Taq DNA Polymerase	2 μL
加水至	50 μL

 

原因4-仪器问题

加样体积失准，PCR仪效果不好等仪器问题；

解决措施：定期校准移液枪、做PCR仪扩增效果验证等。