一、验证F1代KI鼠打靶是否正确

1. 引物设计

   为了验证外源DNA序列是否正确插入，两边同源臂是否打靶正确，使用F1/R1验证5'arm端，F2/R2验证3'arm端，F5/R4验证是否有敲入（小于1 kb短片段）。鉴定为阳性的鼠继续进行Southern Blot的验证。

   

    

2. 预期条带

   条带1：F1/R1扩增的5'arm端，包括野生型+同源臂+部分敲入区域；

   条带2：F2/R2扩增的3'arm端，包括野生型+同源臂+部分敲入区域；

   条带3：F5/R4扩增的敲入后的阳性片段。

   备注：条带1和条带2是对同源臂及敲入区域的验证，片段一般是2 kb以上，扩增难度较大。赛业在交付之前会进行验证，您可以无需再进行验证。

    

3. 电泳结果

   若电泳结果同时有条带1、条带2、条带3，则为阳性敲入鼠。

   若没有扩增出目的条带的则为阴性鼠（野生型或其它突变）。

   

    

4. 测序

   除了PCR鉴定，还需要将产物送测确认。F1/R1扩增产物的测序引物设在5’arm上（图示中的F3），F2/R2扩增产物的测序引物设在3’arm上（图示中的R3）。

   

    

二、F2代KI鼠的纯杂合鉴定

1. 引物设计

   交付的F1代小鼠已验证过同源臂打靶的正确性，现只需通过验证目的基因小于1 kb的片段即可区分纯杂合。

   

    

2. 预期条带

   条带1：F5/R4扩增的敲入后的阳性片段；

   条带2：F4/R4扩增的野生型；

   条带3：F4/R4扩增的敲入片段+部分同源臂。

    

   备注：F4/R4扩增的敲入片段+部分同源臂（条带2）可能会因片段太大或者基因组的提取效果差而扩增不出，不作为主要的基因型判断依据。

    

3. 结果

   若电泳结果只有条带1，则判断为阳性纯合鼠（KI/KI）；

   若电泳结果只有条带2，则判断为野生鼠（+/+）；

   若电泳结果有条带1和条带2，则为阳性杂合鼠（KI/+）。