常见条件性基因敲入鼠如何鉴定？
一、验证F1代CKI鼠打靶是否正确
- 引物设计
F1/R1验证5'arm打靶是否正确，F2/R2验证3'arm打靶是否正确，F4/R4验证敲入区域是否完整，F6/R6验证是否有敲入（小于1 kb短片段）。鉴定的阳性鼠继续进行Southern Blot的验证。
- 预期条带
条带1：F1/R1扩增的5'arm端，包括野生型+同源臂+部分敲入区域；
条带2：F2/R2扩增的3'arm端，包括野生型+同源臂+部分敲入区域；
条带3：F4/R4扩增的敲入区域；
条带4：F6/R6扩增的敲入后的阳性片段。
备注：条带1、条带2、条带3是对同源臂及敲入区域的验证，片段一般是2 kb以上，扩增难度较大。赛业在交付之前会进行验证，您可以无需再进行验证。
- 电泳结果
若电泳结果同时有条带1、条带2、条带3、条带4，则为阳性CKI鼠；
若没有扩增出目的条带的则为阴性鼠（野生型或其它突变）。
- 测序
除了PCR鉴定，还需要将产物送测确认。F1/R1扩增产物的测序引物设在5’arm上（图示中的F3），F2/R2扩增产物的测序引物设在3’arm上（图示中的R3）。
二、F2代CKI鼠的纯杂合鉴定
- 引物设计
交付的F1代小鼠已验证过同源臂打靶的正确性，现只需通过验证目的基因小于1 kb的片段即可区分纯杂合。
- 预期条带
条带1：F5/R5扩增的野生型；
条带2：F6/R6扩增的敲入后的阳性片段。
- 结果
若电泳结果只有条带1，则判断为野生鼠（+/+）；
若电泳结果只有条带2，则判断为阳性纯合鼠（CKI/CKI）；
若电泳结果有条带1和条带2，则为阳性杂合鼠（CKI/+）。
三、鉴定Cre鼠删除情况
纯合或杂合CKI鼠与Cre鼠交配的后代需要鉴定删除情况，验证是否发生删除。验证删除前需要先鉴定Cre基因，若鼠尾为Cre阳性再取特异性组织进行验证。
- 引物设计
在5'arm、3'arm、loxP上下游设计引物。
- 预期片段大小
条带1：F5/F5扩增的野生型；
条带2：F6/F6扩增的删除前阳性片段；
条带3：F7/R7扩增的删除后的片段；
条带4：F7/R7扩增的删除前打靶片段。
注：F7/R7扩增的删除前打靶片段（条带4）可能会因片段太大或者基因组的提取效果差而扩增不出，不作为主要的基因型判断依据。
- 结果
若电泳结果只有条带3，则判断为CKI纯合子，2条染色体均发生删除；
若电泳结果有条带1和条带3，则判断为CKI杂合子，1条染色体发生删除；
若电泳结果有条带2、条带3，则判断为不完全删除的CKI纯合子；
若电泳结果有条带1、条带2和条带3，则判断为不完全删除的CKI杂合子；
若电泳结果只有条带2，则判断为CKI纯合子,且CKI区域没有发生删除；
若电泳结果有条带1和条带2，则判断为CKI杂合子,且CKI区域没有发生删除。
