常见条件性基因敲除鼠如何鉴定？
一、验证F1代flox鼠打靶是否正确
- 引物设计
F1/R1验证5'arm打靶是否正确，F2/R2验证3'arm打靶是否正确，F5/R5、F6/R6验证两端loxP位点。鉴定为阳性的鼠继续进行Southern Blot的验证。
- 预期条带
条带1：F1/R1扩增的5'arm端，包括野生型区域+5'arm同源臂+loxP+敲除区域；
条带2：F2/R2扩增的3'arm端，包括野生型区域+3'arm同源臂+loxP+敲除区域；
条带3：F5/R5扩增的5'arm端，部分同源臂+loxP+部分敲除区域；
条带4：F5/R5扩增的5'arm端，野生型；
条带5：F6/R6扩增的3'arm端，部分同源臂+loxP+部分敲除区域；
条带6：F6/R6扩增的3'arm端，野生型。
备注：条带1和条带2是对同源臂的验证，片段一般是2 kb以上，扩增难度较大。赛业在交付之前会进行验证，您可以无需再进行验证。
- 电泳结果
若电泳结果同时有条带1、条带2、条带3、条带4、条带5、条带6，则为阳性flox鼠（性染色体打靶阳性鼠可能扩增不出条带4、条带6）；
若没有扩增出目的条带的则为阴性鼠（野生型或其它突变）。
- 测序
除了PCR鉴定，还需要将产物送测确认。F1/R1扩增产物的测序引物设在靠近loxP位点的5’arm上（图示中的F3），F2/R2扩增产物的测序引物设在靠近loxP位点的3'arm上（图示中的R4）。
二、F2代flox鼠的纯杂合鉴定
- 引物设计
交付F1代阳性小鼠已验证过同源臂打靶的正确性，其自交产生的后代只需通过验证小于1 kb的目的片段即可，一般设计在特异性好的loxP附近。
- 预期条带
条带1：F5/R5扩增的5'arm端，部分同源臂+loxP+部分敲除区域；
条带2：F5/R5扩增的5'arm端，野生型；
条带3：F6/R6扩增的3'arm端，部分同源臂+loxP+部分敲除区域；
条带4：F6/R6扩增的3'arm端，野生型。
备注：F5/R5、F6/R6两对引物选取其中一对验证即可。
- 结果
若电泳结果只有条带1或者条带3，则判断为阳性纯合鼠（-/-）；
若电泳结果只有条带2或者条带4，则判断为野生鼠（+/+）；
若电泳结果有条带1和条带2或者条带3和条带4，则为阳性杂合鼠（+/-）。
三、鉴定Cre鼠删除情况
纯合或杂合flox鼠与Cre鼠交配的后代需要鉴定删除情况，验证是否发生删除。验证删除前需要先鉴定Cre基因，若鼠尾为Cre阳性再取特异性组织进行验证。
- 引物设计
在5'arm与3'arm上设计引物，位于CKO区域的上/下游。
- 预期条带
条带1：F5/R5扩增的5'arm端删除前，部分同源臂+loxP+部分敲除区域；
条带2：F5/R5扩增的5'arm端,野生型；
条带3：F5/R7扩增的删除后的片段；
条带4：F5/R7扩增的删除前打靶片段；
条带5：F5/R7扩增的野生型。
注：F5/R7扩增的删除前打靶片段（条带4）和野生型（条带5）,可能会因片段太大或者基因组的提取效果差而扩增不出，不作为主要的基因型判断依据。
- 结果
若电泳结果只有条带3，则判断为CKO纯合子，2条染色体均发生删除；
若电泳结果有条带2和条带3，则判断为CKO杂合子，1条染色体发生删除；
若电泳结果有条带1、条带3，则判断为不完全删除的CKO纯合子；
若电泳结果有条带1、条带2和条带3，则判断为不完全删除的CKO杂合子；
若电泳结果只有条带1，则判断为CKO纯合子,且CKO区域没有发生删除；
若电泳结果有条带1和条带2，则判断为CKO杂合子,且CKO区域没有发生删除。
注：删除结果与Cre鼠的删除效率有关，也与实验取材有关，比如删除是发生在内皮细胞，但是取材不是特别精细，含有其他组织就会影响结果的判断。
