两条引物进行基因型鉴定

 

1. 引物设计

将引物设计在敲除区域的两端，即F1和R1引物，通过条带大小判断基因型。

 

2. 预期条带

条带1：F1/R1扩增的敲除后的阳性片段；

条带2：F1/R1扩增的野生型片段；

 

3. 电泳结果

若电泳结果只有条带1，则判断为阳性纯合鼠（-/-）；

若电泳结果只有条带2，则判断为野生鼠（+/+）；

若电泳结果有条带1和条带2，则为阳性杂合鼠（＋/－）。

 

注：若条带2因大于2 kb导致无法扩增，扩增出条带1只能判定为阳性鼠（杂合或者纯合）。

 

三条引物进行基因型鉴定

 

1. 引物设计

若是所用的酶可以扩增出野生型的片段，用上文中的F1/R1这对引物就可以鉴定出纯杂合。但当敲除的片段过大，而所用的酶无法扩增出野生型的条带时，F1/R1这对引物不能区分纯杂合基因型，所以需要再设计一条位于敲除区域内的引物，使用3条引物短片段体系判断基因型。

 

2. 预期条带

条带1：F1/R1扩增的敲除后的阳性片段；

条带3：F1/R2扩增的野生型片段。

 

3. 电泳结果

若电泳结果只有条带1，则判断为阳性纯合鼠（-/-）；

若电泳结果只有条带3，则判断为野生鼠（+/+）；

若电泳结果有条带1和条带3，则为阳性杂合鼠（+/-）。

 

注：以上实验可以3条引物放在一个体系中扩增，也可以分为2个体系进行扩增。目的扩增片段一般都小于1 kb，使用短片段体系即可。另，如果两个条带大小相差小于100 bp，在有实验误差的情况下，同一胶图可能较难区分两条条带，建议分成2个体系进行扩增，先判断是否阳性，再进一步判断纯杂合。