a.目标蛋白不表达或表达量极低，也有可能提取的蛋白降解；

b.提取方法错误，未提取到目标蛋白；

c.一抗抗体选择错误或一抗失效，一抗浓度低；

d.选择的二抗种属有问题，导致一抗和二抗不匹配，或二抗失效；

e.实验所用的试剂失效（如ECL发光液等）；

f.转膜失败（如三明治转膜结构顺序不对）或过度封闭；

g.曝光时间设置不合适；

h.个别磷酸化的蛋白可能需要添加诱导剂才能表达。