ALS小鼠模型怎么选？从SOD1、TDP-43到C9ORF72看懂机制与差异

ALS发病机制与模型研究

前文将肌萎缩侧索硬化症（渐冻症, ALS）的症状和治疗手段做了一个小小的总结，今天我们来聊一聊ALS的机理及相关的动物模型。在说机理之前，一个绕不开的话题就是运动神经系统及运动神经元，因为该疾病造成的损伤都是针对运动神经系统的，虽然肌肉也受到了影响，但只能算得上是“次生灾害”。

本文围绕ALS（肌萎缩侧索硬化症，俗称渐冻症）的机制与动物模型展开。疾病症状、运动系统损伤、遗传线索与模型观察属于不同层次的信息，后文分别介绍。

ALS为什么会损伤运动神经系统？

主动运动（Voluntary Movement）的信号传递始于大脑中的运动皮层和脑干(Brainstem)，运动皮层负责制定运动计划，并为动作发号施令；而脑干则负责一些更基础的运动功能，如呼吸，运动和姿势的维持等，很多时候不需要主动意识的参与；在大脑里还有两个辅助部门，基底神经节（Basal Ganglia）和小脑（Cerebellum），基底神经节负责运动指令的准备和纠正一些在命令传递过程中的错误；小脑在运动的全过程中行使协调各部门职能的责任。皮层和脑干的命令发出以后，传递到了“地方官员”脊髓或运动神经池（Motor Neuron pools）中，注意这里有的信息是直达运动神经节，有的则是通过脊髓神经传达给运动神经池；运动神经池中的各个运动神经元就开始给肌肉下达干活（运动）的指令。同时脊髓也会通过各种感觉神经元将运动的结果汇总分析，如果分析出简单问题则自行处理，复杂问题则上报“中央（运动皮层或脑干）”等待指示。在正常的机体中，这一套行政体系可以有条不紊的进行。ALS的病变就是发生在由上运动神经元（Upper Motor Neuron, UMN）和下运动神经元（Lower Motor Neuron, LMN）所构成的运动命令信息传递链上。UMN指的是不与肌肉直接联系的皮层，脑干和脊髓中的神经元（不包括小脑和基底神经节这种辅助性脑区的神经元）；而LMN则指的是将运动指令直接传向骨骼肌的运动神经元。在ALS中，运动神经损伤可导致肌肉失神经支配及继发萎缩；这并不意味着肌肉与神经肌肉接头不存在相关病理改变。

图1. ALS和运动神经系统[1-2]

运动通路的“行政体系”是帮助理解的比喻，不能替代严格神经解剖学分层。ALS研究还涉及神经肌肉接头与肌肉等相互作用，不能仅用单一神经元指标概括整个疾病。

SOD1、TARDBP、FUS与C9ORF72涉及哪些机制？

以下按原文引用文献梳理研究历史。基因发现时间、病例占比、风险因素和功能认识具有来源年代及人群背景；“目前”及“接近10个”等表述对应所引时期，不表示已更新为当下完整基因清单。

每个病患的ALS的病程和症状差异很大，相关致病因素也是五花八门，相继有报道称脑外伤、高血压、吸烟等因素与ALS有关，但目前公认与ALS关系最密切的还是年龄和遗传。年龄自不用说，是很多神经退行性疾病的最高风险。遗传性因素也不惶多让，虽然遗传性的ALS占比不高，但仍然有20多个基因被列入了ALS的元凶名单。接下来我们就挑几个重点的来详述。

SOD1：正常酶功能与突变相关机制

首先登场的是最早发现的超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1, SOD1），1993年发现该蛋白的突变与ALS扯上了关系，虽然现在看来它对ALS的影响不是最大的（大概有20%的遗传性ALS与之相关），但第一的身份让它万众瞩目。SOD1的工作本来是将细胞产生的超氧阴离子自由基转化成过氧化氢和氧气。但不能把突变SOD1相关ALS简单归结为丧失这项酶功能；其病理涉及毒性功能获得等机制，氧化应激是研究方向之一；不过也有说法是突变的SOD1本身也会聚集形成内涵体，这就有点像PD中的α-synuclein了，但是在ALS中最重要的蛋白聚集并不是SOD1，而是“另有其人”。由于发现得早，做SOD1研究的人多，大家又陆陆续续地把其致病机理扯到了影响轴突运输，影响脊髓毛细管出血，诱发炎症，破坏髓鞘等方面。

SOD1突变模型与Sod1敲除模型回答不同问题。前者不能统一解释为抗氧化酶失活，后者有助于研究正常功能缺失；二者的病理与运动表型不能直接互换。

ALS2、SETX、VAPB等基因涉及哪些过程？

接下来，2001年发现了早发型ALS相关的ALS2，该基因编码的蛋白负责核内体转运；2002年发现了参与RNA加工的SETX；2004年发现了与内质网和胞内膜转运相关的VAPB；2006年ANG和CHMP2B加入了ALS致病基因家族，前者参与RNA加工，后者与核内体转运和自噬相关。

TARDBP与TDP-43异常定位有何关系？

到了2008年，另一个大魔王浮出水面，这就是和AD中的tau，PD中的α-syn，HD（亨廷顿病）中的htt并称“四大恶人”的TDP-43，编码这个蛋白的基因叫做TARDBP，中文全名是反式激活反应DNA结合蛋白43（transactive response DNA-binding protein 43 kDa，TDP-43），虽然该基因的突变也就在不到5%的家族性和不到1%的散发性ALS中出现，看似不过“泯然众基因”而已，不过在高达97%的病患的运动皮层和脊髓中都发现了TDP-43的内涵体（出现TDP-43内涵体可以不需要这个基因本身的突变，和AD中的tau何其相似！！），让其摇身一变，炙手可热。TDP-43平时主要参与和mRNA相关的工作，比如转录调控，mRNA的剪切加工，转运或者代谢什么的。但在ALS的研究中，人们发现本应该在细胞核内工作的TDP-43大量涌入了细胞质，从而导致了细胞核内“劳动力”不足，TDP-43负责的mRNA无法加工成成品，同时聚集在细胞质中的TDP-43开始躁动，形成包涵体，危害神经元的存活。

图2. TDP-43沉积和ALS的相关基因的陆续发现[4]

FUS与FIG4的研究线索

2009年，对于ALS的遗传研究来说又是一个丰收的年份，除了发现另一个核内体转运融合蛋白FIG4以外，还发现了FUS（Fused in sarcoma）蛋白。FUS是一个RNA结合蛋白，它的突变在家族性ALS和散发性ALS中的贡献分别是4%和1%。针对这个蛋白最开始的研究是在脂肪肉瘤领域（liposarcoma），可以说它本来的功能和TDP-43有一定程度的类似，它们的突变都能促使各自蛋白发生聚集，从而杀死神经元。

UBQLN2等基因与蛋白稳态研究

再往后，SPG11（胞内转移酶，与轴突生长相关），OPTN（自噬相关），ATXN2（RNA加工），VCP（自噬），SIGMAR1（蛋白酶系统，自噬）和UBQLN2（泛素蛋白酶系统，自噬）等相继被揪出。其中UBQLN2（2011年发现）编码该蛋白的UBQLN2基因位于X染色体上，原文所引历史研究将其作为ALS遗传研究的重要线索，虽然其突变只在ALS人群中占2.1%，但是否可以成为阐明ALS发病的男女差异的突破口呢？

C9ORF72重复扩增与ALS、FTD的关联

但是，2011年ALS真正的主角不是UBQLN2，而是C9ORF72，不得不说，起这个名字的人真是太懒了，C9指的是9号染色体，ORF72指的是第72个开放阅读框。ALS病人中这个C9ORF72片段中的内含子部分中，有一个GGGGCC序列会发生400-2000次的重复，而在大部分非ALS患者中这个片段的重复在10次以内。这种大量重复在家族性ALS中占比36.7%，散发性ALS占比为6.3%。另外值得注意的是，C9ORF72的这种改变在家族性的FTD（额颞叶痴呆，以后讲痴呆的时候会详细介绍）中也是常客（25%）。所以在遗传性的ALS中会经常出现FTD的身影。如果是在延髓性的ALS中，C9ORF72相关的病患比例会进一步提高（44%）。从对这个基因的命名就可以看出，目前C9ORF72的功能还并不是十分确定，只有少数报道说它参与自噬和内涵体运输。有意思的是，该基因发生改变的ALS病患大多是在欧美，而在亚洲绝大部分地区是相当罕见的。

本段重复次数与36.7%、6.3%、25%、44%等比例沿用文献[4]的历史研究描述，应结合当时的人群、检测方法和病例分类理解，不作为当前各地区的统一比例或诊断阈值。

接下来的时间里，虽然也陆陆续续发现了接近10个与ALS相关的基因，但还没有出现C9ORF72同样量级的ALS基因。所有的基因详情和比较见图3，图中为最热点的ALS基因标上了颜色，没有标颜色的并不代表不重要，只是目前研究相对较少而已。

图3. ALS的相关基因信息列表[4]

ALS小鼠模型有哪些类型与应用？

以下保留原文基于2019年综述[5]的模型案例与数量。该部分用于理解策略差异，不作为现货目录、最新模型数量或模型性能保证。

ALS不像PD一样有较好的化学诱导模型，本文重点讨论通过遗传操作构建的模型，因此很多ALS转基因小鼠也应运而生。如图3所示，绝大部分ALS相关基因都是常染色体显性的，因此具体模型能否出现相应症状仍需结合变异、表达水平及小鼠背景验证。如前文所述，SOD1因为先发优势，针对其开发的ALS模式小鼠非常之多，截止至2019年年中，已经有接近30种之多；TARDBP（编码TDP-43）相关也有超过30种；FUS有大概接近10种；其余的如UBQLN2，VCP和VAPB的动物模型则比较少。

另外有人可能要问C9ORF72呢？这个当然是有的，不过由于这个基因的外显子突变是极少的，致病原因是内含子中的片段重复，所以一般是通过BAC转基因或者病毒载体递送等策略构建（也有敲除的）。因此，虽然其发现较晚，但因为其与ALS相关性目前最高，对它的研究很多。综合目前的多种实验结果，科学家们提出了三种关于C9ORF72的假说，其一是过度重复的片段造成该蛋白功能的缺失，其二是这些重复所转录的正义和反义RNA产生的毒性，其三就是这六个碱基编码的二肽重复蛋白产生的毒性。

就动物模型的构建方式而言，过表达ALS相关基因所造成的神经元死亡和运动障碍更加明显，可以用来模拟患者中晚期的病情（图4中绿色箭头代表），而敲入（Knock in）相关基因对小鼠所造成的影响较小，部分模型可用于研究较早期变化；不能据构建类型对所有模型作固定临床分期。

“中晚期”和“早中期”是本文对部分模型用途的概括，不是所有过表达与敲入模型的固定临床阶段。表达水平、遗传背景、年龄与检测终点均会影响结果[5]。

ALS相关遗传机制可涉及功能缺失及毒性功能获得等不同方面，基因敲除小鼠仍然是我们研究这些基因功能和ALS深层机理的重要工具。在这些基因中Tardbp全身纯合敲除会影响胚胎存活，不能按普通可繁育疾病品系理解，其杂合子表现出一定的对运动神经元的保护作用。而SOD1基因敲除小鼠却出现了更为严重的外周神经疾病，这与SOD1的抗氧化功能是吻合的。

上述杂合敲除的保护性描述需要限定具体研究与终点，不能推广为降低TDP-43在所有背景下都有保护作用。靶基因缺失、致病变异和蛋白异常定位应分别解释。

一些点突变小鼠依然可以表现出很好的ALS病理特征。如VCP R155H在老龄时有50%的运动神经元死亡，同时也能产生细胞内的TDP-43包涵体；不过行为症状上这些模型仍然有缺憾，该小鼠运动能力的减弱较轻微。

人源化小鼠模型随着近几年基因编辑技术的发展而成为热点，这种方法在将小鼠原有基因的位置上替换上人类的对应基因。人源化FUSδ14小鼠，会让小鼠细胞中的FUS定位发生紊乱，从而造成运动神经元的死亡。

如果对ALS相关模型小鼠感兴趣，可以参考2019年Giorgio发表的一篇综述[5]，里面汇总了上百种ALS小鼠的表型和病理特征，算是小编目前看到最全的了。如果您需要ALS相关的小鼠模型，赛业生物一站式服务平台可以为您提供！

图4. ALS小鼠模型的应用[5] 

C9ORF72相关机制涉及蛋白功能缺失、重复RNA与二肽重复蛋白毒性等不同方向。BAC转基因、病毒载体递送、敲入与敲除不能混称为同一种构建；具体重复长度、表达设计与病理结果需按模型资料核对。

转基因、敲入、敲除与人源化ALS模型如何选择？

如何结合运动行为与神经病理解释ALS模型？

原文VCP R155H案例说明，运动神经元损失与运动能力变化并不一定同步。研究中应同时明确基因型、遗传背景、观察年龄和指标，不能把分子或病理阳性直接等同于完整临床病程[5]。

ALS模型与研究服务

模型选择可了解神经及肌肉模型，按研究需求分别考虑转基因小鼠定制、基因敲入小鼠定制、基因敲除小鼠定制与全基因组人源化模型资源。行为、病理及功能研究需求可结合表型分析及神经及肌肉药效评价沟通。

以上入口用于了解研究资源，并不表示原文每个等位基因均有对应现货。更多资料见技术指南中心。

参考文献及引用图片来源

1. Dale Purves et al. Neuroscience. Sinauer Associates. 2018. 9781605353807,1605353809

2. https://en.wikipedia.org/

3. Al-Chalabi A , Hardiman O , Kiernan M C , et al. Amyotrophic lateral sclerosis: moving towards a new classification system[J]. Lancet Neurology, 2016, 15(11):1182-1194.

4. Al Sultan A, Waller R, Heath P, Kirby J. The genetics of amyotrophic lateral sclerosis: current insights. Degener Neurol Neuromuscul Dis. 2016;6:49-64

5. Giorgio F D , Maduro C , Fisher E M C , et al. Transgenic and physiological mouse models give insights into different aspects of amyotrophic lateral sclerosis[J]. Disease Models & Mechanisms, 2019, 12(1):dmm037424.

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