剪接位点突变如何验证？看懂AI预测与Minigene实验的分工

异常剪接验证需要回答什么问题？

可变剪接是Pre-mRNA通过不同的剪切方式将外显子重连，形成不同mRNA，并产生不同种类蛋白的现象。由于可变剪接的存在，使得一个基因可以编码多种不同的蛋白质。

可变剪接的发生是一个调控精密的过程，受到剪切蛋白基因特定序列（顺式作用元件）的影响，即使是微小的变化如单碱基突变都可能导致异常剪接的发生。比如我们较为熟知的杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)和脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy,SMA）这两种罕见病，其发病机制都与异常可变剪接密切相关。

当我们通过检测临床样品，获得一些可能与可变剪接相关的突变位点时，应该怎样开展验证呢？下面给大家介绍。

异常剪接为什么会发生？

可变剪接的产生，是调控剪接的蛋白和存在于内含子和外显子的顺式作用元件相互作用的结果。它们包括内含子剪接增强子(ISE)、内含子剪接沉默子(ISS)、外显子剪接增强子(ESE)、 外显子剪接沉默子 (ESS)和AG-exon-GT保守序列等，这些顺式作用元件能与相应的蛋白结合，调控外显子拼接的准确性和效率。另外，调控剪接蛋白的表达往往会存在时空特异性，即在不同发育阶段和组织部位，相同蛋白的表达模式也会存在差异，这样就可能产生不同的剪接类型。

当这些顺式作用元件的序列发生突变，即使是点突变，也可能产生异常的剪接类型。常见的异常剪接类型包括整个或部分外显子缺失、整个或部分内含子保留、多个外显子缺失等。异常剪接的结果可能会造成外显子部分序列缺失，从而导致蛋白缺失长片段氨基酸；也可能出现非3倍数的插入或缺失，导致移码突变或产生终止信号，并最终导致正常蛋白功能的缺失。

内含子剪接增强子与沉默子分别简称ISE和ISS；外显子增强子与沉默子分别为ESE和ESS。上述“AG-exon-GT”用于概括常见外显子两侧的剪接边界，GT为DNA记法，RNA中对应GU，不代表全部剪接事件都只有这一种边界形式。顺式元件与细胞内调控因子的共同作用需要结合序列背景理解。

剪接位点突变如何验证？

生信分析与AI预测分别提供哪些信息？

通过测序，我们可获得大量的SNP突变位点。有些位点位于基因非编码区，如内含子、启动子、基因间隔区等，有些位点位于临近内含子和外显子交界处，我们可以挑选这些位点进行生信分析，筛选出可能与可变剪接相关的突变位点。

传统的生信分析预测工具，是以经典的剪接模型作为标准，进行筛选。但是可变剪接的机制是精密且复杂的，所以传统的生信分析算法无法准确模拟实际的剪接情况，常常会遗漏较多的致病位点。

通过大数据分析的AI预测模型可为这一问题提供辅助筛选依据。我们可以结合传统的生信分析和AI模型对我们的位点进行筛选，候选出我们感兴趣的位点，再开展下一步的验证实验。罕见病数据中心（RDDC）的AI工具可以进行RNA剪接预测。通过AI神经网络模型和生信数据算法逻辑进行处理，通过分析碱基突变中对蛋白编码翻译影响较大的剪接异常，为筛选可能影响剪接及疾病相关功能的候选变异提供依据，不能单独确定致病原因。简单来说，只需要输入目的基因、转录本ID、突变位点位置和突变类型，即可得到预测结果。

RNA剪接预测属于候选位点筛选环节。使用时应核对基因、转录本版本、变异坐标体系和变异写法；具体工具输入要求以当前界面为准，本文不把模型输出直接解释为临床诊断。

Minigene实验如何比较野生型与突变型剪接？

常规的验证思路是构建点突变细胞系，然后通过细胞表型分析和cDNA检测等方法验证异常可变剪接的猜想。但是当突变位点数量较多时，构建点突变细胞的时间和成本会提高。所以在这之前，先通过便捷的Minigene系统验证，可为后续研究提供前期验证依据，本文不据此给出量化成功率。

Minigene是在体外将含有突变位点或野生型位点的外显子及旁侧内含子克隆至载体上，然后将载体转染至细胞中，接着通过RT-PCR和测序，分析剪接的情况。大致工作原理是：克隆位点处可以装载待研究的外源外显子及旁侧内含子，在克隆位点上下游分别存在载体自带的外显子A和B。并且已经根据外显子A和B序列设计了RT-PCR的扩增引物，用于后续的检测。将构建好的载体转染到细胞中，野生型组会表达出含有外显子A+外源外显子+外显子B的mRNA。通过RT-PCR及转录产物测序可分析剪接产物的组成与序列。如果突变组可以产生异常的可变剪接，则表达出与野生型不一致的mRNA。

图 1 利用Minigene系统体外验证异常可变剪接流程

野生型与突变型构建用于比较剪接产物。扩增片段的大小提示产物差异，转录产物测序进一步明确连接方式；这些结果对应所用载体、插入片段和细胞背景，不等同于完成内源基因组位点鉴定[2]。

EYS案例：Minigene如何验证异常剪接？

Minigene已经被广泛应用于异常剪接的研究。有研究者通过家系分析及测序发现EYS存在变异位点（图2），并且可能与遗传性视网膜变性发生相关。通过生信分析，他们发现有两次突变位点可能影响可变剪接，分别是: c.3877+1G>A和c.2992_2992+6delinsTG。

接下来，他们利用Minigene系统，验证了预测结果：第一个位点c.3877+1G>A，将24号内含子、25号外显子和25号内含子装载至pSPL3载体中，转染ARPE-19细胞系，通过RT-PCR扩增及测序发现该位点可以产生异常可变剪接（图3）。

另外一个位点也是以相同的方法验证：将18号内含子、19号外显子和19号内含子装载至pSPL3载体中，分别转染HEK293T和ARPE-19细胞系，通过RT-PCR扩增及测序发现该位点可以产生异常可变剪接（图3）。

图 2 EYS存在多个变异位点可能与色素性视网膜炎发生有关

图 3 Minigene系统验证异常可变剪接的发生

原始研究[1]对两个变异均使用了HEK293T与ARPE-19细胞。c.2992_2992+6delinsTG与外显子19跳跃相关，c.3877+1G>A与外显子25跳跃相关；不同细胞中还可见不同的剪接产物。因此，案例支持实验体系内的剪接改变，不能把所有条带概括为完全相同的单一结果。

Minigene与点突变细胞系有什么区别？

Minigene可作为患者RNA分析的补充证据[2]。如果研究目标还包括内源转录、蛋白或细胞功能，可结合点突变细胞模型继续验证；不存在仅凭一项预测或一项报告实验就覆盖全部证据层次的固定规则。

如何理解Minigene结果及其适用范围？

mRNA的异常剪接与疾病发生密切相关，通过研究其发生机制对于相关药物的开发非常必要，但也有较多的困难需要克服。最为棘手的是在通过测序等手段获得大量变异位点时如何高效、准确地筛选出可能的致病位点，并科学地展开验证是非常关键的。为了避免做无用功，使用生信及AI预测可变剪接的发生，可作为候选位点筛选的辅助途径。再结合Minigene系统的实验验证，可判断变异在该实验体系中对剪接的影响，不能仅凭这一结果确定临床致病性。

原始EYS研究指出，体外剪接结果与构建所含DNA序列及受试细胞有关[1]。因此，“准确”与“便捷”应结合具体体系理解，不代表本文提供了统一准确率、成本、周期或成功率保证；剪接效应也不自动等于蛋白功能与临床结论。

剪接变异研究相关工具与业务

候选位点研究可了解RDDC罕见病数据中心。继续进行内源背景研究时，可结合点突变细胞系服务与点突变细胞库评估模型选择；转录、蛋白或功能验证需求可了解体外检测服务。

更多资料见技术指南中心。可围绕目标转录本、变异、候选细胞与验证终点沟通需求；具体Minigene项目是否可承接、范围与交付形式需结合项目确认。

参考文献

[1]Westin, Ida Maria et al. “EYS mutations and implementation of minigene assay for variant classification in EYS-associated retinitis pigmentosa in northern Sweden.” Scientific reports vol. 11,1 7696. 8 Apr. 2021,

[2]Gaildrat, Pascaline et al. “Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants.” Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) vol. 653 (2010): 249-57.

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