基因敲除依赖于非同源末端连接（NHEJ）介导的DNA双链断裂（DSB）修复，NHEJ是哺乳动物细胞中主要的、高效的DNA双链断裂修复途径。即使修复不完美（引入indels），也常常能达到破坏基因功能的目的，效率相对较高。另一方面，基因敲入则依赖于同源定向修复（HDR）机制，需要在制造双链断裂的同时，提供一个包含目标插入序列（两侧带有与切割位点上下游同源的臂）的DNA模板，HDR在哺乳动物细胞中效率远低于NHEJ。它通常只在细胞周期的S/G2期活跃。总而言之，基因敲入因其对低效且精确的HDR途径的绝对依赖、需要额外复杂模板的设计和递送，使其技术难度和实验复杂性远高于主要利用高效且容错的NHEJ途径的基因敲除。