donor的设计最为重要的是要保证同源重组的效率。而donor的选择（ssODN 或质粒 dsDNA）、编辑位点与引导分子切割位点的距离、同源臂设计和是否引入同义突变等均能影响同源重组的效率。

（1）ssODN具有合成简便、重组效率高和对细胞损伤小等特点，常用于点突变细胞系构建。而基因敲入细胞系可以使用ssODN或者dsDNA（质粒DNA）。较小的片段（如只是引入标签等）可以使用ssODN。但是长片段敲入需要用质粒法构建dsDNA载体。需要注意的是敲入的片段不能过长，一般不超过5kb（包含抗性和荧光筛选），过长会降低重组效率。

（2）突变位点尽量靠近双链DNA缺口，以保证同源重组的效率。一般而言，以ssODN为donor的理想距离是在10bp以内；以质粒为donor的理想距离是在1000 bp以内。

（3）同源臂的长度与同源性程度对重组效率具有重要的影响。一般而言，加长同源臂能一定程度上提高重组效率，并且插入的片段越大，所需要的同源臂长度越长，而同源臂一般选取1000- 1500 bp较为合适。而且在同源臂模板的选择上，同源臂建议以待突变的目的细胞基因组为模板扩增，避免不同细胞基因组差异导致同源臂不同源，降低重组效率。

（4）当断裂的双链DNA以donor为模板被修复后，而引导分子靶标序列和PAM序列仍然完整时，基因编辑系统会继续切割靶标，产生多种突变基因型。为了避免这样的情况，可以将引导分子的PAM或邻近PAM的序列进行同义突变。