主要考虑如下三个因素：

• 由于目的基因的多转录本引起的蛋白残留

基因一般含有多个不同的转录本，在选择敲除位点时，有时会很难保证覆盖所有的转录本，而未被影响到的转录本就有可能正常转录翻译从而表达出具有部分功能域的蛋白。因此，我们在设计KO细胞方案时，应综合考虑数据库基因信息、文献，甚至通过预实验，从而尽可能地覆盖多个转录本，当然，这就对方案设计的人员有较高的技术和经验要求。

• 由于基因的可变剪切引起的蛋白残留

可变剪切指当某个外显子被破坏或缺失时，其转录的mRNA前体通过不同的剪接方式产生不同的mRNA剪接异构体的过程，是调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制。当我们构建KO细胞时，敲除位点处外显子被切割后，包含在内含子中的RNA剪接规则同时被破坏，在一定情况下，缺失的外显子序列在RNA剪切阶段被略过，直接将其上游的外显子与下游的外显子相连，形成一种全新的mRNA，从而继续蛋白的翻译。

• 外因——Western Blot抗体的选择

Western Blot检测技术是基于抗原抗体的特异性结合的原理，且抗体并不是识别整个目的蛋白，而是识别某段特定氨基酸序列或其中某部分功能结构域，即抗体的特异性。因此，在采用Western Blot检测KO细胞是否存在蛋白残留表达时，如果选择的敲除位点相对靠后，而抗体与蛋白的结合区域若存在于敲除位点之前，便可能会出现抗体与N端残留蛋白的结合，从而导致Western Blot检测条带的出现。不过对于这种情况，目的蛋白的功能很可能已经丧失。