单细胞分离方法中，常见的有限稀释法（limiting dilution cloning, LDC）和流式细胞术分选法等。此外，克隆筛选单细胞打印系统、ClonePix高通量细胞克隆筛选系统和细胞成像技术等新技术也逐渐用于细胞单克隆化或确认单克隆性，有效提高筛选的效率和精度。

该方法是将混合细胞池以一定梯度进行稀释，再以0.5cell/孔或以下的要求进行铺板。该方法是现今最常用的，具有操作简单、对设备要求较低等优点。但依赖人工操作，耗时久、效率低、花费大量的96或384孔板等缺点也需要关注。并且筛选得到的克隆只是基于稀释比例得到的理论单克隆，难以确定所选细胞是单克隆。该方法通过结合成像系统技术，记录每个单孔中的克隆初始状态和生长情况，则可以提高有限稀释法的精度。

依据细胞的大小、细胞内含物复杂程度、细胞内所含的荧光染料、细胞表面膜蛋白等参数，可以通过流式细胞仪从多克隆细胞池中分选出单克隆。一般可以分选下列两种情况的细胞，一是在慢病毒载体中插入了荧光标记，转染后细胞内表达荧光蛋白，并通过其进行分选。第二种是过表达某种蛋白于细胞膜表面，此时用带有荧光标记的抗体进行孵育，再通过流式进行分选。使用流式细胞仪分选单细胞，单克隆形成率高，并且可以与单克隆成像系统连用，确定单克隆。