Cell：天津医科大学团队揭示SelO催化NAD⁺水解维持线粒体稳态的新机制

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）是一种在能量代谢中起核心作用的代谢物，以氧化还原对（NAD⁺和NADH）的形式存在。NAD⁺分布在细胞各处，但呈现高度区室化特征。线粒体NAD⁺（mNAD⁺）的稳态对多个生命过程至关重要。尽管研究已达近百年，但负责将NAD⁺运输至线粒体的转运蛋白SLC25A51直到最近才鉴定出来。

与其他代谢物不同，NAD通过在两种形式之间转化参与代谢途径，但其本身并不被消耗。NAD⁺可被SARM1降解，而在蛋白质ADP-核糖基化或蛋白质去乙酰化过程中，NAD⁺也会被动消耗。不过，这些蛋白质修饰或去修饰过程受到多条信号通路的调控，并非主动控制NAD⁺的方式。因此，导致线粒体内NAD⁺降解的机制仍有待阐明。

近日，天津医科大学王霆教授、傅源教授和电子科技大学余秋景教授领导的研究团队深入解析了线粒体内NAD⁺降解的机制。他们发现，线粒体蛋白SelO能够响应基质pH值升高而水解NAD⁺，从而直接调控脂质代谢并维护线粒体稳态。这项突破性成果于3月9日发表在《Cell》杂志上，揭示了一种此前未知的NAD⁺降解途径。

研究人员利用AlphaFold2结构模型，通过Vina、AutoDock 4和LeDock三种工具来筛选NAD结合蛋白。他们构建了肝脏特异性SelO敲除小鼠（其中SelO^fl/fl小鼠由赛业生物提供），并通过腺病毒回补野生型和突变体SelO，以检测代谢和线粒体表型。他们解析了细菌同源蛋白ydiU与NAD⁺和Mn²⁺形成的晶体结构，以了解催化口袋和底物结合模式。他们还测定了线粒体NAD⁺水平，分析了线粒体的结构和功能，并通过定量质谱、Flag pulldown和免疫共沉淀等实验确定了蛋白质相互作用。

利用AlphaFold2结构模型和三种软件来筛选NAD结合蛋白，确定SelO是线粒体内特异性的NAD⁺水解酶

↓

通过分析同源蛋白ydiU的晶体结构和SelO的预测结构确定关键的结合位点

↓

转录组学和代谢组学分析表明SelO与脂质代谢途径之间存在关联，定量质谱等分析证实SelO与脂肪酸氧化酶直接结合并抑制脂质氧化

↓

后续分析发现SelO催化反应并不是抑制正常的线粒体活动，而是作为一种响应机制，以防止线粒体过度激活

1. SelO是线粒体内特异性的NAD⁺水解酶

代谢反应是由代谢物（作为底物）与蛋白酶结合而启动的，因此导致mNAD出现波动的酶必定是一种NAD结合蛋白。于是，研究人员利用多个软件对所有人类蛋白质的AlphaFold2结构进行计算机模拟筛选，发现了9个定位在线粒体基质的候选蛋白，其中仅有SELENOO（SelO）的敲降显著提高细胞和线粒体的NAD⁺水平。SelO是一种蛋白质单磷酸腺苷酸化（AMPylation）修饰酶。

体外实验证实，纯化的SelO蛋白能够将NAD⁺水解为烟酰胺单核苷酸（NMN）和AMP。该反应需要Mn²⁺作为辅因子，且无法水解FAD和NADP⁺这两种NAD类似物，凸显了其底物特异性。NAD在线粒体呼吸耦合的质子泵送过程中起着关键作用，该过程可提高基质pH值。值得注意的是，SelO的活性会随着pH值升高（7.2→8.2）而显著增强，这表明SelO的水解活性会对线粒体呼吸的变化做出响应。SelO的瞬时敲降会造成广泛的代谢组学变化，尤其是在脂质方面。

2. SelO中保守的C端CSS残基对NAD⁺水解至关重要

SelO的同源蛋白存在于后生动物、植物、真菌和细菌中，且高度保守。研究人员发现，SelO在大肠杆菌中的同源蛋白ydiU也能水解NAD⁺，并以Mn²⁺作为必需辅因子。通过分析ydiU晶体结构和AlphaFold SelO预测结构，他们发现催化作用依赖于C端的半胱氨酸-丝氨酸-丝氨酸（CSS）残基。

人类SelO的C端尾部含有罕见的硒代半胱氨酸（第667位），该残基对其AMPylation活性并非必需。有意思的是，C667位于NAD⁺可裂解的P-O键旁，这表明C667极有可能作为亲核试剂启动水解反应。与C667相比，C(Se)667形式表现出更高的NADase活性，而C667A突变则抑制了SelO的NADase活性。这些数据揭示了SelO如何结合并水解NAD⁺，其C端残基在其中发挥关键作用。

图1. SelO水解NAD⁺的机制探究

3. SelO催化的NAD⁺水解抑制脂质利用

SelO在多种组织中普遍表达，其中在人类和小鼠的肝脏中表达水平最高。于是，研究人员构建了肝脏特异性SelO敲除小鼠（其中SelO^fl/fl小鼠由赛业生物提供）。与预期一致，肝脏中SelO的缺失导致肝脏mNAD水平升高。转录组分析表明，SelO敲除后上调基因主要集中在脂肪酸氧化（FAO）通路。代谢组学分析也表明，许多改变的代谢物是脂质分子，它们主要集中在下游的代谢物。细胞和生物体层面的组学分析均表明，SelO广泛调控代谢途径，并对脂质代谢产生显著影响。

在进一步分析后，他们发现SelO KO小鼠表现出脂质利用率增加，体现在呼吸交换率（RER）降低。同时，高脂饮食喂养的KO小鼠肝脏中的脂质沉积以及甘油三酯和非酯化脂肪酸水平均下降。此外，KO小鼠肝脏线粒体内的多种FAO中间代谢物含量增加，尤其是中短链酰基辅酶A（CoA）衍生物。这些结果暗示了SelO与脂质代谢之间存在特殊关联。

4. SelO与脂肪酸氧化酶直接结合

于是，研究人员接下来分析了SelO是否会选择性地与脂质代谢酶结合。定量质朴和免疫共沉淀分析表明，SelO与参与FAO循环的多个酶之间存在相互作用，包括HADHA和HADHB等。HADHA和HADHB组成线粒体三功能蛋白（MTP），催化了脂肪酸β-氧化过程中的三个关键步骤。SelO在体内可直接与纯化的HADHA/HADHB复合物结合。

NAD⁺对HADHA催化羟基酰基-CoA转化为酮酰基-CoA至关重要。体外分析表明，在添加SelO蛋白后，HADHA酶活受到抑制。C667A突变体虽能与MTP复合物高效结合，但未能抑制HADHA活性，表明SelO通过降解MTP复合物周围的NAD⁺优先抑制β-氧化。细菌ydiU同样与FAO酶结合并抑制脂肪酸利用。这些结果表明，SelO/ydiU直接与FAO复合物相结合，优先抑制脂质氧化。

5. SelO催化的NAD⁺水解对线粒体稳态至关重要

SelO KO可增加肝脏中的mNAD⁺水平并减少脂质沉积，表明SelO抑制具有益处。不过出乎意料的是，KO小鼠的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）升高，指示肝脏损伤。研究人员发现，SelO催化的NAD⁺水解合理地抑制了线粒体呼吸。SelO被基质pH值升高（标志着线粒体呼吸增强）激活，其过度激活会导致线粒体应激。这表明SelO催化反应的主要作用并不是抑制正常的线粒体活动，而是作为一种响应机制，以防止线粒体过度激活。

电镜分析显示，SelO KO小鼠线粒体的碎片化程度更高，且随年龄增长而加剧。这些小鼠的线粒体基质呈现浓缩状态，进一步支持了SelO对脂质氧化具有特殊的影响。他们还发现KO小鼠的线粒体外膜完整性受损，与之相对应的是小鼠的炎症反应增强。回补野生型SelO可逆转线粒体碎片化和膜损伤，而C667A突变体则不能挽救这些表型，表明这些效应主要是由SelO的NADase活性介导的。这些结果表明，SelO能够对基质pH值升高做出响应，进而保护线粒体免受持续的代谢过度激活。

图2. SelO调控线粒体稳态

图3. 图形化摘要（图片来自原文）

这项研究填补了线粒体内NAD⁺降解的空白，完善了NAD⁺区室化调控网络。研究定义了SelO的三项功能：水解NAD⁺、抑制脂质分解代谢以及抵御线粒体应激。研究人员认为，肝脏KO小鼠并未因脂质分解的改善而获益，表明SelO应当被定义为线粒体健康的保护因子，而不仅仅是脂质代谢的调节因子。

此外，SelO保守的C端含有一个罕见的硒代半胱氨酸，由UGA密码子编码，当硒元素不足时，UGA容易被识别为终止信号，产生无NADase活性的截短蛋白。这项研究首次揭示了硒元素与线粒体健康之间的密切关系。

传统上虽将NAD⁺视为有益的代谢物，但这项研究也表明不受控制的mNAD⁺可能导致不良影响，这凸显了在适当水平上对mNAD⁺进行调控的必要性。此外，NAD⁺的失调也与多种人类疾病相关，进一步强调了精准调控NAD⁺水平的必要性。因此研究人员认为，未来需要更精细的策略来最大化NAD⁺干预的益处。

Jia et al., NAD⁺ hydrolysis catalyzed by SelO is required for mitochondrial homeostasis, Cell (2026), https://doi.org/10.1016/j.cell.2026.01.033