Nature：中科院钱友存/宋昕阳团队解析载脂蛋白调控肠道免疫稳态的新机制

在这项研究中，研究人员利用无标记定量蛋白质组学技术比较了无菌小鼠和正常小鼠的回肠黏液蛋白质组。他们将流式细胞术与16S rRNA基因测序相结合（APOL9-seq）来分析APOL9结合菌群。他们还构建出Apol9a/b双敲除小鼠以及Tlr2^-/-（由赛业生物提供）、Myd88^-/-和Tlr4^-/-等基因敲除小鼠。此外，他们还通过透射电镜观察了APOL蛋白对细菌外膜囊泡（OMV）释放的影响。

为了理解宿主的肠黏膜屏障如何响应微生物刺激，研究人员采用无标记定量蛋白质组学技术比较了正常小鼠与无菌小鼠回肠黏液中的宿主分泌因子。他们发现，常规饲养小鼠回肠黏液中APOL9a/b表达显著上调。Apol9a/b在小鼠肠道和肝脏组织中均呈高表达水平，尤其是在小肠各段。在无菌小鼠或经抗生素处理的小鼠中，Apol9a/b表达显著下降，且受微生物依赖的干扰素信号通路调控。

接下来，研究人员试图解析APOL9的功能。通过整合APOL9结合菌群的流式细胞分选与16S rRNA基因测序（APOL9-seq），他们发现APOL9对人类拟杆菌属、副拟杆菌属等菌株具有相似的结合偏好性。随后他们发现人类同源蛋白APOL2与拟杆菌目菌株结合的效率与小鼠APOL9a/b相当，且APOL2也在人类肠上皮细胞中表达。这些结果表明，小鼠和人类肠道APOL分子均以保守方式结合微生物，且在肠道微生物组中优先与拟杆菌目细菌结合。

为深入解析APOL9a与共生拟杆菌结合的分子机制，研究人员选取人类肠道优势共生菌——多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）作为研究对象。他们推测，微生物的鞘脂合成及其产物可能参与了APOL9a的结合过程。为了验证这一点，他们构建了多个菌株，敲除了鞘脂合成通路中的一系列基因（图1）。结果显示，丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）或神经酰胺合酶的缺失完全阻断了APOL9a与拟杆菌的结合，而神经酰胺激酶也是这种结合所必需的。

脂质组学分析表明，多形拟杆菌的神经酰胺激酶负责神经酰胺-1-磷酸（Cer1P）分子的生物合成，且Cer1P生物合成通路基因在拟杆菌目菌株中高度保守。通过脂质免疫沉淀-质谱分析和蛋白质-脂质覆盖实验，他们发现小鼠APOL9a/b和人类APOL2均能与Cer1P高亲和力结合（图1）。这些结果表明，宿主APOL蛋白通过与细菌膜上的Cer1P分子直接相互作用来实现与多形拟杆菌的特异性结合。

图1 APOL蛋白通过Cer1P与肠道共生拟杆菌结合^[1]

研究人员进一步发现，APOL9a/b与多形拟杆菌结合后并未导致细菌裂解或生长抑制。不过，通过透射电子显微镜，他们观察到细菌膜起泡现象（图2）。这表明APOL9a/b和APOL2会引发膜应激，进而诱导这些细菌产生外膜囊泡（OMV）。不过，当细菌中的Cer1P合成缺失时，APOL分子无法诱导过量的OMV产生（图2）。转录组分析显示，APOL蛋白的结合能激活细菌的细胞膜生物发生和防御过程的相关基因表达，进而促进OMV释放，这促使他们进一步探究APOL蛋白是否能通过共生OMV调节宿主肠道屏障功能。

通过转录组分析，他们发现APOL9的缺失导致小鼠肠上皮的MHC-II分子下调。研究人员使用了Tlr2^-/-基因敲除小鼠（由赛业生物提供），发现在DC–IEL（树突状细胞-上皮内淋巴细胞）共培养体系中，OMV显著增加了干扰素-γ（IFNγ）的产生，该细胞因子是诱导肠上皮MHC-II的关键因子。对Apol9a/b缺陷小鼠进行OMV口服给药后，他们发现多形拟杆菌来源的OMV能够恢复回肠的IFNγ水平和MHC-II分子表达。这些结果显示，APOL9可诱导拟杆菌OMV的释放，通过多细胞相互作用促进上皮MHC-II表达。

图2 APOL蛋白靶向肠道拟杆菌，诱导OMV释放^[1]

考虑到上皮MHC-II分子在维持肠道免疫稳态中发挥关键作用，研究人员对野生型和Apol9a/b^-/-小鼠的CD45⁺免疫细胞进行单细胞RNA测序分析。结果显示，Apol9a/b的缺失导致小鼠回肠中CD4⁺CD8αα⁺上皮内淋巴细胞显著减少，且这些细胞的淋巴细胞特征基因表达水平降低（图3）。流式细胞术分析证实，这种细胞亚群的减少主要发生在回肠部位。对Apol9a/b^-/-小鼠进行OMV给药不仅恢复了其上皮MHC-II水平，还挽救了这些小鼠的CD4⁺CD8αα⁺上皮内淋巴细胞水平。

在鼠伤寒沙门氏菌口服感染模型中，Apol9a/b敲除小鼠表现出更高死亡率、更严重的肠道炎症和更强的细菌扩散能力，而OMV给药可显著改善感染结局（图3）。进一步研究证实，APOL9a/b的抗感染保护作用依赖于拟杆菌目细菌的存在，在缺乏拟杆菌目的微生物群重建小鼠中，APOL9a/b无法发挥保护作用，且对系统性感染无明显影响。这些结果表明，APOL9a和APOL9b通过其在肠道中的免疫调节功能，在肠道感染过程中发挥保护作用。

图3 APOL9a/b调控上皮内CD4⁺CD8αα⁺细胞及黏膜感染^[1]