Nature Microbiology
CRISPR–Cas系统进化分类更新及罕见变异研究

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本文提出了CRISPR–Cas系统的最新进化分类，涵盖了2个大类、7种类型及46个亚型，相较五年前的分类新增13个亚型。研究还揭示了罕见变异的生物学特性，并探讨了其在原核生物及病毒中的分布模式，为基因编辑领域提供关键参考。

 

文献概述
本文《CRISPR–Cas系统的更新进化分类，包括罕见变异》，发表于《Nature Microbiology》杂志，回顾并总结了CRISPR–Cas系统分类的最新进展。研究者们基于基因组和宏基因组数据，对CRISPR–Cas系统进行了系统发育分析，发现新类型和亚型的系统在进化过程中具有独特的基因结构和蛋白结构域，并且这些系统在原核生物中的分布频率较低，主要存在于未被充分研究的病毒基因组中。文章还探讨了III型系统中的环寡腺苷酸信号通路以及V型和IV型系统中新的功能机制。

背景知识
CRISPR–Cas系统是原核生物中重要的适应性免疫机制，广泛用于基因编辑和生物技术领域。CRISPR–Cas系统分为两大类，第一类系统依赖多个Cas蛋白形成效应复合物，第二类系统以单一Cas蛋白（如Cas9、Cas12、Cas13）为基础。近年来，随着基因组和宏基因组测序数据的快速增长，新型CRISPR–Cas系统不断被发现，其中许多属于罕见变异。这些罕见系统在进化过程中可能经历了功能分化，例如某些IV型系统可切割靶DNA但不产生DNA断裂，而V型系统可抑制DNA复制而不切割DNA。此外，研究还揭示了III型系统中环寡腺苷酸（cOA）信号通路的多样性，包括不同的传感器和效应蛋白，如CARF、SAVED结构域及HEPN RNase等。这些通路的复杂性导致III型系统的功能异质性，同时部分新发现的系统如III-G、III-H和III-I，其适应模块缺失，可能依赖其他系统提供crRNA。

 

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研究方法与实验
本研究通过系统发育分析、结构域比对和基因组共线性分析，对已知CRISPR–Cas系统进行重新分类，并识别新的系统类型和亚型。研究团队整合了结构生物学、进化基因组学和功能研究数据，使用AlphaFold3和Cryo-EM结构预测新型效应复合物的三维构象，并通过结构域分析揭示Cas蛋白的进化轨迹。此外，研究还分析了CRISPR–Cas系统在不同微生物基因组中的分布模式，发现已知系统较为普遍，而新型罕见系统主要分布于宏基因组的“长尾”部分，提示其可能具有未被挖掘的生物学功能。

关键结论与观点

• 最新分类将CRISPR–Cas系统划分为2个大类、7种类型及46个亚型，相较五年前增加13个亚型。
• III型系统中发现新的亚型III-G、III-H和III-I，均缺少适应模块，可能依赖其他CRISPR–Cas系统提供crRNA。
• III型系统中环寡腺苷酸（cOA）信号通路的多样性较高，包括多个CARF和SAVED结构域的传感器及HEPN RNase等效应蛋白。
• 新发现的IV型和V型系统具有不依赖DNA切割的免疫机制，例如抑制DNA复制或转录。
• III型和VII型系统间存在结构域融合，提示其进化过程中可能经历功能模块的重组。
• III-I系统中的Cas10蛋白缺乏典型聚合酶结构域，但通过结构域比对可识别为Cas10同源蛋白。
• III-G系统中Csx26蛋白取代Cas11，形成独特的效应复合物，表明CRISPR–Cas系统存在多样的蛋白替换机制。
• 新发现的I-E2、I-F4等系统包含HNH核酸酶，这些酶通常来源于移动遗传元件，提示CRISPR–Cas系统与转座子间存在频繁的基因水平转移。
• III-A2系统中NucC核酸酶可能直接响应cOA信号，拓展了CRISPR–Cas系统中信号效应蛋白的多样性。
• 系统分布分析显示，已知系统在原核生物中较为常见，而新系统多见于宏基因组，提示其可能具有未被充分研究的生态功能。

研究意义与展望
本研究为CRISPR–Cas系统的进化分类提供了更系统的框架，有助于识别和注释新型基因编辑工具。未来研究可聚焦于罕见变异的实验功能验证，并探索其在生物技术中的潜在应用，例如新型RNA靶向或DNA调控机制。此外，研究揭示了CRISPR–Cas系统与转座子的协同进化路径，为基因组工程和合成生物学提供新的效应蛋白来源。

 

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结语
CRISPR–Cas系统在适应性免疫和基因编辑技术中具有核心作用。本研究基于进化系统发育分析，更新了CRISPR–Cas系统的分类标准，新增了VII型系统及多个III型亚型，揭示了其在结构域组织和功能机制上的多样性。研究还发现部分系统如III-G、III-H和III-I缺乏适应模块，可能依赖其他系统提供crRNA。此外，部分新型系统具有HNH或PD-(D/E)xK核酸酶，提示其在靶向DNA复制抑制中的作用。未来，这些罕见系统可能在生物技术中提供新的基因编辑策略，尤其是在RNA靶向和调控机制方面。研究强调了系统发育分类在CRISPR研究中的重要性，并为新型基因编辑工具的挖掘提供理论支持。

 

Kira S Makarova, Sergey A Shmakov, Yuri I Wolf, Rodolphe Barrangou, and Eugene V Koonin. An updated evolutionary classification of CRISPR–Cas systems including rare variants. Nature Microbiology.