南通大学王勇军教授团队揭示星形胶质细胞ET-1系统决定脊髓损伤后小胶质细胞表型的分子机制

脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）往往激活常驻和外周来源的炎症细胞，释放大量的炎性物质，引发脊髓的继发性损伤。在该病理进展中，炎症细胞发生连续的表型、功能和分子变化。多组学研究表明，脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞呈现功能的异质性，包括经典激活的M1促炎表型和M2抗炎表型，以及在不同阶段具有重叠特征的几种过渡状态。诸多证据显示，在脊髓损伤急性期，M1表型小胶质细胞/巨噬细胞占据主导地位长达一周，而M2表型由于M1型的迅速极化仅短暂存在。促炎M1型和抗炎M2型小胶质/巨噬细胞的动态变化与损伤脊髓的功能结局密切相关。然而，迄今为止，脊髓损伤急性期控制小胶质细胞/巨噬细胞向M1表型转化的关键调控分子仍不十分清楚。

最近，南通大学王勇军教授课题组在《Advanced Science》（中文译名《先进科学》）上在线发表了题为“Astrocytic ET-1 System Determines Microglia Phenotype Following Spinal Cord Injury”的研究论文。该课题组发现，大鼠脊髓损伤后，凝血酶可通过结合蛋白酶激活受体-1（PAR-1），特异性激活星形胶质细胞内的内皮素-1（ET-1）系统；分泌的ET-1进一步与小胶质细胞表面的ETA及ETB受体结合，进而激活转录共激活因子YAP，最终促使急性期小胶质细胞向促炎M1表型极化。此外，选择性抑制PAR-1或ET-1的活性，可显著减少损伤部位M1型炎症细胞的数量，有效改善大鼠后肢运动功能。

研究材料与方法

在这项研究中，研究人员采用了星形胶质细胞特异性ET-1敲降病毒（星形胶质细胞特异性ET-1敲降病毒由赛业生物提供）。他们研究用了转录组学、生物信息学、QPCR、免疫荧光染色等。

技术路线

研究结果

首先，该团队通过构建大鼠脊髓撞击伤模型，探索了脊髓损伤后0d、1d、4d和7d不同亚型内皮素的激活情况。结果显示，脊髓损伤后0d、1d、4d和7d，ppET-1与ET-1成熟肽表达显著上调（图1A-D）。采用免疫组织化学检测结果显示，在脊髓损伤后不同时间点，ET-1主要在GFAP和S100β阳性的星形胶质细胞中诱导表达，而在神经元、小胶质细胞和内皮细胞中表达丰度没有显著变化（图1E-G）。此外，采用ELISA检测脊髓损伤后0d、1d、4d和7d大鼠血浆中ET-1水平，评估其是否能够反映脊髓星形胶质细胞ET-1系统的激活情况。结果表明，损伤后1d，星形细胞ET-1系统的激活可导致血浆ET-1水平的急剧升高（图1H）。这些数据表明，脊髓损伤主要诱导星形胶质细胞ET-1系统的激活，并可以通过血浆中的ET-1参数指示。

接着，为了明确星形胶质细胞ET-1系统激活与小胶质细胞表型转换之间潜在的关系，研究人员采用AAV5介导的星形胶质细胞ppET-1敲低病毒（ppET-1敲低病毒由赛业生物提供）和ET-1药物抑制剂来检测ET-1对小胶质细胞表型转换的影响。免疫组织化学染色结果显示，AAV5转染脊髓星形胶质细胞特异性敲低ppET-1后，CD86+ IBA1+和iNOS+ IBA1+小胶质细胞的比例显著降低，而CD206+ IBA1+和Arg1+ IBA1+小胶质细胞的比例却显著提升（图2A-C）。在脊髓损伤部位鞘内注射ET-1抑制剂Aminaftone的结果与AAV5干预结果一致（图2D-F）。上述结果表明，脊髓损伤后星形胶质细胞ET-1系统的激活参与了小胶质细胞向M1型极化过程。

进一步的分子调控机制研究表明，星形胶质细胞来源的ET-1通过与小胶质细胞ETA和ETB受体相互作用，激活转录因子YAP，调控小胶质细胞的促炎表型（图3）。

随后，深入研究了调控星形胶质细胞ET-1系统激活的关键因子。结果表明，脊髓损伤诱导激活的凝血酶与星形胶质细胞ET-1系统激活密切相关，凝血酶通过PAR-1受体，激活星形胶质细胞ET-1系统且ET-1的产生与凝血酶之间成浓度依赖性（图4）。

最后，研究人员通过采用药物方法干预凝血酶信号途径，免疫组织化学检测脊髓损伤处不同表型小胶质细胞/巨噬细胞聚集情况。结果表明，在脊髓损伤急性期，PAR-1抑制剂显著减少1 d、4 d 和7 d时损伤部位M1型小胶质细胞/巨噬细胞细胞数量，同时增加了M2型细胞数量（图5A-C）。上述结果表明，抑制凝血酶介导的星形胶质细胞ET-1系统激活，能显著减少损伤处M1表型小胶质细胞的数量。行为学测试表明，PAR-1和ET-1抑制剂有利于大鼠运动功能恢复（图5D-H）。以上结果表明，抑制凝血酶激活的星形胶质细胞ET-1系统，显著促进大鼠后肢运动功能恢复。

研究结论

综上所述，本研究首次揭示了脊髓损伤诱导凝血酶激活，该丝氨酸蛋白酶通过RhoA/NF-κB和MAPKs/NF-κB信号通路，激活星形胶质细胞ET-1系统；星形胶质细胞来源的ET-1，通过与小胶质细胞ETA和ETB受体相互作用，调控YAP信号通路，促进损伤处小胶质细胞向M1型极化的关键分子机制（图6）。脊髓损伤后，PAR-1和ET-1抑制剂可以显著减少M1型小胶质细胞的数量，明显改善大鼠的后肢运动功能。该工作为脊髓损伤神经保护提供了新的药物靶点和干预措施。

参考文献

赛业生物 病毒包装平台

赛业生物依据多年病毒包装平台的经验，可以提供不同质量标准的AAV、LV、ADV等病毒，广泛运用到各种细胞系模型的构建和活体动物的体内研究中。针对AAV病毒包装，采用三质粒共转染的方法和先进的纯化工艺，可提供高纯度、高滴度、多种血清型的AAV包装定制化服务，客户多篇文献引用发表，满足基因治疗研究者的个性化选择。本实验中的星形胶质细胞特异性ET-1敲降病毒由赛业生物提供。