Nature Methods
mScarlet3-S2实现双色3D STED和4D SIM成像

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本文报道了一种高度光稳定的单体红色荧orescent蛋白mScarlet3-S2，其光稳定性较前代提升29倍，适用于3D STED和SIM成像，实现对内质网-核膜界面的高分辨率结构解析。

 

文献概述

本文《A highly photostable monomeric red fluorescent protein for dual-color 3D STED and time-lapse 3D SIM imaging》，发表于《Nature Methods》杂志，回顾并总结了新型红色荧光蛋白mScarlet3-S2的开发及其在超分辨显微成像中的应用。该蛋白的光稳定性显著优于现有RFPs，为双色3D STED和3D SIM成像提供了关键工具。

背景知识

红色荧光蛋白（RFPs）在活细胞超分辨显微成像中具有重要价值，尤其是在双色成像应用中。然而，传统RFPs在高能激光照射下容易发生光漂白，限制了其在长时间或三维成像中的使用。刺激发射损耗（STED）显微镜依赖高强度激光实现纳米级分辨率，但对荧光蛋白的光稳定性提出了极高要求；结构照明显微镜（SIM）同样因需多次图像采集而对光稳定性敏感。因此，开发兼具高光稳定性和亮度的RFP是推动活细胞成像的关键。本研究以mScarlet3为模板，通过靶向光敏位点的定向进化，成功获得mScarlet3-S2，克服了现有RFPs在光稳定性方面的限制，实现了长时间3D STED和SIM成像，为解析亚细胞结构动态提供了新的可能。

 

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研究方法与实验

研究团队通过高通量筛选系统对mScarlet3进行定向进化，引入甲硫氨酸到组氨酸的突变，以增强光稳定性。通过在U-2 OS细胞中融合H2B、F-actin、线粒体等亚细胞结构进行光稳定性评估，并结合3D STED和SIM成像技术，系统性比较不同突变体在高强度激光照射下的荧光衰减情况。此外，作者还通过双色3D STED成像，结合HaloTag与BD626HTL染色，解析了内质网-核膜（ER–NE）界面的三维结构，识别出多种接触位点形态，并分析其分布特征。

关键结论与观点

• mScarlet3-S2在宽场（WF）显微镜下表现出29倍于mScarlet3的光稳定性，在5.2 W cm⁻²激光照射下，其半衰期（t1/2）为380秒，显著优于mScarlet3（48秒）和mScarlet-H（146秒）。
• 3D STED成像中，mScarlet3-S2可支持超过150层的Z-stack成像，清晰解析内质网-核膜接触位点的三维结构，包括点状、丝状和分支状等多种形态。
• 双色3D STED成像揭示ER–NE接触位点呈现极化分布，基底核膜的接触密度高于顶端侧，且在核内陷区域无接触位点。
• mScarlet3-S2还支持长时间3D SIM成像，维持线粒体嵴和F-actin结构的高分辨率，即使在400次成像循环后仍保留约50%的荧光信号。
• 研究发现，非平面的三维ER连接结构，如非共面三路接点和四路接点，挑战了传统ER网络模型，揭示了更复杂的膜拓扑组织。

研究意义与展望

该研究为活细胞超分辨成像提供了高效的红色荧光蛋白工具，解决了现有RFPs在3D STED和SIM中的光稳定性瓶颈。未来研究可进一步探索不同ER–NE连接形态的分子机制，如是否与特定信号传导或膜重塑蛋白相关。此外，mScarlet3-S2可与其他近红外探针兼容，为多色超分辨成像和动态生物过程追踪提供支持。

 

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结语

本文报道了mScarlet3-S2这一高度光稳定的红色荧光蛋白，其在3D STED和SIM成像中表现出卓越的性能，显著优于现有RFPs。通过双色成像，研究团队首次揭示了ER–NE接触位点的三维形态多样性及其极化分布特征，拓展了对亚细胞结构组织的认知。mScarlet3-S2的开发不仅为超分辨成像提供了新的工具，也为解析亚细胞动态和结构异质性研究奠定了基础，具有广泛的应用前景。

 

Ya Ding, Wenting He, Kunhao Wang, Lin Yuan, and Pingyong Xu. A highly photostable monomeric red fluorescent protein for dual-color 3D STED and time-lapse 3D SIM imaging. Nature Methods.