Nucleic Acids Research
Photocontrolled dissociation and toehold-mediated strand displacement-based synergistic regulation of CRISPR-Cas12a

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该研究开发了一种双向、多轮调控策略，利用toehold介导的链置换和光控解离实现对Cas12a反式切割活性的动态调控。通过整合DNA密码学，构建了一个分层的时间授权系统，显著提升CRISPR-Cas12a在生物传感、基因编辑和生物工程中的应用潜力。

 

文献概述
本文《Photocontrolled dissociation and toehold-mediated strand displacement-based synergistic regulation of CRISPR-Cas12a》，发表于《Nucleic Acids Research》杂志，回顾并总结了CRISPR-Cas12a系统的反式切割活性调控策略。由于现有的单一方向调控策略难以实现对Cas蛋白活性的精确时空控制，该研究提出了一种双向、多轮调控策略，使Cas12a的活性可在“开启”和“关闭”状态之间循环切换，并通过紫外线（UV）照射重新激活。研究还整合了DNA密码学，构建了一个分层的时间授权系统，提升了DNA密码学的安全性，为高级基因编辑、生物传感和生物工程应用提供了新的调控工具。

背景知识
CRISPR-Cas系统作为原核生物适应性免疫系统的重要组成部分，已被广泛用于基因编辑、分子诊断和生物传感等领域。Cas12a因其高效的反式切割活性，成为CRISPR系统中广泛使用的效应蛋白之一。然而，Cas12a的非特异性切割特性可能导致反应系统中其他成分的非预期降解，因此需要开发更精确的时空调控方法。当前调控Cas12a活性的策略主要包括crRNA化学修饰、结构调控、DNA激活子设计及Cas蛋白拮抗剂等，但这些方法通常只能实现单向调控，缺乏可逆性。本文通过结合toehold介导的链置换（TMSD）和光控解离策略，实现了Cas12a活性的双向、多轮调控，为构建更安全、更可控的CRISPR工具提供了新思路。

 

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研究方法与实验
研究团队通过在crRNA互补链上引入中间修饰（如Spacer C6或碱基A插入），设计了一种光敏阻断剂（pcDNA），该阻断剂可在双链形成时结合crRNA并抑制Cas12a的反式切割活性。随后，通过toehold介导的链置换反应（TMSD），加入短链激活剂可替换阻断剂，从而恢复Cas12a活性。在光控解离实验中，紫外光（365 nm）可断裂光敏阻断剂，使其从crRNA上解离，释放Cas12a的活性。研究进一步优化了激活剂长度、阻断剂浓度及紫外光照时间，以实现最佳调控效果，并评估了系统在多轮激活-阻断循环中的稳定性与可重复性。

关键结论与观点

• 中间修饰位点影响Cas12a活性：研究发现，当修饰基团插入crRNA的中央位置时，Cas12a的反式切割活性显著降低，而末端修饰对活性影响较小，表明中央修饰可有效干扰crRNA与靶DNA的结合。
• 双向调控系统的实现：通过TMSD和光控解离的协同作用，Cas12a的活性可在“开启”和“关闭”状态之间动态切换，且系统具备多轮可逆调控能力。
• 多轮调控效率高：在多个调控循环中，系统在“开启”状态可恢复95.4%的Cas12a活性，在“关闭”状态则抑制至12.4%，表明该系统具备良好的可逆性和稳定性。
• 分层时间授权系统构建：通过整合DNA密码学，研究构建了一个分层时间授权系统，其中不同调控层级（激活剂、阻断剂、UV光）可依次控制Cas12a的活性，提升密码学系统的安全性和可编程性。
• 系统兼容性强：该调控策略适用于不同长度和序列的crRNA-DNA复合物，且在多种反应条件下均保持高效调控能力，具备广泛的应用潜力。

研究意义与展望
该研究提出的双向、多轮调控策略为CRISPR-Cas系统在生物传感、基因编辑和DNA计算等领域的应用提供了更精细的调控工具。未来可进一步结合DNA逻辑电路，开发响应特定生物信号的智能调控系统，拓展CRISPR技术在精准医疗、药物递送和合成生物学中的应用范围。

 

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结语
本研究成功开发了一种基于toehold介导链置换和光控解离的双向调控策略，实现了对CRISPR-Cas12a反式切割活性的精确时空控制。该策略不仅支持多轮激活-抑制循环，还通过整合DNA密码学构建了分层时间授权系统，显著提升了CRISPR系统的安全性和可编程性。这一方法为基因编辑、生物传感和合成生物学中的动态调控提供了新的工具，也为开发可逆、可控的CRISPR技术奠定了基础。

 

Jia-ni Wu, Changjiang Li, Zhujun Liu, Jun Dai, and Tongbo Wu. Photocontrolled dissociation and toehold-mediated strand displacement-based synergistic regulation of CRISPR-Cas12a. Nucleic Acids Research.