Nucleic Acids Research
ALLEGRO算法实现跨物种sgRNA文库设计

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该研究提出了一种高效CRISPR sgRNA设计算法ALLEGRO，能够为超过2000种真菌物种设计最小化文库，同时实现基因组编辑的高效率和特异性，为跨物种基因组研究提供全新工具。

 

文献概述
本文《Kingdom-wide CRISPR guide design with ALLEGRO》，发表于《Nucleic Acids Research》杂志，回顾并总结了如何利用ALLEGRO算法设计适用于真菌界多个物种的高效sgRNA文库。研究通过生物信息学与实验验证相结合，展示了该算法在基因组编辑中的广泛适用性。

背景知识
CRISPR-Cas9技术广泛用于基因组编辑，但在跨物种应用中仍存在显著挑战，包括sgRNA设计的种属特异性、序列保守性以及脱靶效应等问题。传统工具如MINORg在小规模数据中表现良好，但在大规模、系统发育多样化的数据集中效率低下。ALLEGRO通过整数线性规划方法，解决大规模种属sgRNA设计中的优化问题，确保sgRNA在多个物种中同时有效。该研究以真菌界为模型，设计并验证sgRNA文库，为基因编辑工具的泛用性提供了理论和实验基础。

 

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研究方法与实验
ALLEGRO的输入包括真菌物种和目标基因集，首先通过DIAMOND进行直系同源基因分析，随后使用uCRISPR预测sgRNA效率。算法通过整数线性规划优化sgRNA数量，确保最小文库覆盖所有目标基因。实验验证涵盖Kluyveromyces marxianus、Komagataella phaffii、Yarrowia lipolytica和Saccharomyces cerevisiae等多个真菌物种，并进一步扩展到Rhodotorula araucariae。实验使用质粒构建和RNP递送系统，结合化学筛选与Sanger测序验证基因编辑效果。

关键结论与观点

• ALLEGRO可在1000种Ascomycota真菌中设计仅9条sgRNA的文库，实现全物种基因组编辑。
• 实验验证显示ALLEGRO设计的sgRNA在多个物种中均具有高效基因编辑能力，且具有良好的特异性。
• ALLEGRO支持两种设计策略：Track A用于任意基因的覆盖，Track E用于每个基因在每种物种中的覆盖，用户可自定义多重性因子m。
• 通过引入PAM–distal区域的单碱基错配，可显著减少文库规模，同时不影响编辑效率。
• 研究还开发了通用Cas9–RNP递送系统，适用于未测试物种，如Rhodotorula araucariae。

研究意义与展望
ALLEGRO的提出为跨物种基因组编辑提供了高效、可扩展的sgRNA设计解决方案，适用于包括真菌界在内的广泛生物界。其算法设计支持灵活调整，适用于不同实验需求，为比较基因组学、进化研究和生物技术应用提供sgRNA设计标准。未来ALLEGRO有望扩展到其他非真菌物种，实现更广泛基因编辑平台的开发。

 

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结语
本研究介绍了一种高效的sgRNA设计算法ALLEGRO，通过整数线性规划，可在真菌界中设计最小化且功能强大的sgRNA文库。实验验证显示，该文库在多个物种中均具有良好的编辑效果，为跨物种基因组研究提供了通用工具。ALLEGRO的灵活性和高效性使其适用于大规模基因编辑项目，为基因编辑、合成生物学和功能基因组研究提供了重要支持。该算法的公开可用性将推动更多非模式物种的研究，为生物技术与进化基因组学提供新机遇。

 

Amirsadra Mohseni, Reyhane Ghorbani Nia, Aida Tafrishi, Stefano Lonardi, and Ian Wheeldon. Kingdom-wide CRISPR guide design with ALLEGRO. Nucleic Acids Research.