Cell（IF=42.5）：复旦/上海交大团队发表Cell文章，揭示肿瘤免疫逃逸的新机制

研究人员收集了两批头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者的样本，通过CODEX成像、单细胞RNA测序和空间转录组测序等技术，分析了伤害感受神经元密度与免疫细胞分布的相关性。之后，他们构建了三种口腔癌小鼠模型，包括SCC7鳞状细胞癌、B16F10黑色素瘤和MC57G纤维肉瘤，并构建了Scn10a^CatCh-EYFP小鼠和Ccl5⁻^/⁻小鼠（由赛业生物提供）。他们采用光遗传学技术激活舌部伤害感受神经元，通过化学遗传学方法抑制TDLN伤害感受神经元，并结合局部注射CGRP受体拮抗剂、重组SLIT2蛋白等手段解析信号通路机制。

研究人员首先对69例HNSCC患者的肿瘤组织进行多重免疫荧光分析，以定量伤害感受神经元。他们发现，伤害感受神经元（CGRP+TRPV1+PGP9.5+）的密度与患者术前疼痛评分呈正相关。免疫浸润分析显示，在伤害感受神经元丰富-疼痛高的组别中，M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）显著增加。

空间分析显示，TAM与伤害感受神经元存在空间邻近性。伤害感受神经元丰富区域的M1样和M2样TAM显著高于神经元稀少的区域。CyTOF分析显示，在伤害感受神经元丰富-疼痛高的组别中，初始和效应CD8+ T细胞比例降低，单核细胞比例升高，而这些外周单核细胞是TAM的主要来源。

接下来，研究人员在三种口腔癌小鼠模型上开展分析，发现TAM耗竭未改变肿瘤体积，但显著缓解了肿瘤诱导的机械性痛觉超敏反应（图1）。对HNSCC患者组织进行单细胞RNA测序和空间转录组分析后，他们发现在TAM附近的肿瘤细胞内，痛觉感知和轴突发生相关基因的表达显著上调（图1），表明处于TAM压力下的肿瘤细胞会激活伤害感受神经元。

通过进一步分析，他们发现TAM处理后内质网应激相关基因的转录和蛋白水平上升，其中ATF4是TAM处理后富集程度最高的转录因子。在人类HNSCC组织中，靠近TAM的肿瘤细胞显示出更高的ATF4表达。通过CRISPR技术敲除Atf4基因可以缓解肿瘤诱导的机械性痛觉超敏反应（图1），表明肿瘤细胞通过ATF4激活伤害感受神经元。

研究人员还发现，TAM处理以ATF4依赖性方式提升了肿瘤细胞中SLIT2的合成和分泌，该蛋白参与了神经元激活、痛觉敏化和轴突导向。在肿瘤细胞内，SLIT2与ATF4共定位，而TAM耗竭可降低SLIT2的表达（图1）。同样地，敲除Slit2基因可缓解肿瘤诱导的痛觉超敏反应，而注射重组小鼠SLIT2蛋白可以逆转这种现象。这些结果表明，处于TAM压力下的肿瘤细胞通过ATF4介导的SLIT2分泌激活伤害感受神经元。

图1 肿瘤细胞通过ATF4-SLIT2轴激活伤害感受神经元^[1]

考虑到颈部肿瘤引流淋巴结（TDLN）与口腔癌邻近，且作为抗肿瘤反应的免疫枢纽，研究人员推测，肿瘤支配伤害感受神经元的激活可能影响了附近支配TDLN的伤害感受神经元（TDLN-iNN）。

之后，他们构建了Scn10a^CatCh-EYFP基因敲除小鼠（由赛业生物提供），并通过473 nm蓝光对伤害感受神经元进行时空特异性激活。他们观察到，对舌黏膜进行30分钟光遗传学刺激后，Scn10a^CatCh-EYFP小鼠颈部淋巴结中的血液灌注（由神经元释放的血管舒张性神经肽介导）显著增加，证明对舌部伤害感受神经元（tongue-iNN）的光遗传学刺激可触发颈部LN-iNN的激活（图2）。

图2 对tongue-iNN的光遗传学刺激可触发颈部LN-iNN的激活[1]

那么，TDLN-iNN活性是否影响肿瘤生长？他们发现，对Scn10a^CatCh-EYFP小鼠的光遗传学刺激可促进肿瘤生长，而这种效应在切除颈部淋巴结的小鼠中没有出现，表明TDLN对伤害感受神经元介导的肿瘤生长至关重要。CGRP（降钙素基因相关肽）作为伤害感受神经元的主要效应分子发挥作用。研究人员观察到，光遗传学刺激后TDLN中的CGRP水平升高，而通过化学遗传学手段抑制TDLN-iNN可逆转该现象。这些结果表明，TDLN-iNN通过刺激CGRP分泌而促进肿瘤生长。

在后续分析中，他们发现光遗传学刺激会导致TDLN中的CD8+ T细胞、γδ T细胞和经典树突状细胞（cDC）比例下降，这表明TDLN-iNN活性将TDLN重塑为免疫抑制状态。通过化学遗传学手段抑制TDLN-iNN或敲除Calca基因（编码CGRP）可逆转这一现象；当Slit2或Atf4缺失时，抑制TDLN-iNN也不能促使CD8+ T细胞等免疫细胞比例增加，表明ATF4-SLIT2轴对于伤害感受神经元介导的TDLN重塑至关重要。由此可见，TDLN重塑是由SLIT2介导的TDLN-iNN激活和CGRP释放驱动的。

之后的一系列分析显示，免疫抑制状态的TDLN通过TAM促进肿瘤生长。通过分析TDLN驻留免疫细胞与TAM之间的配体-受体相互作用，研究人员发现Ccl5与Ccr5/Ccr1配对是相互作用最强的配对。有意思的是，CD8+ T细胞和树突状细胞是TDLN中Ccl5的主要来源，而TAM中的Ccr5/Ccr1表达水平最高。

免疫抑制状态的TDLN分泌CCL5减少，而体外实验表明CCL5可促进TAM向M1型极化。对Ccl5⁻^/⁻小鼠进行TDLN-iNN的化学遗传学抑制未能降低肿瘤体积或M2样TAM比例。相反，在Scn10a^CatCh-EYFP小鼠中，肿瘤内注射CCL5蛋白可以有效逆转光遗传学刺激导致的肿瘤体积增大及M2样TAM比例升高。在HNSCC队列中，伤害感受神经元丰富-疼痛高组患者血浆中的CCL5水平较低。这些结果表明，免疫抑制状态的TDLN通过降低CCL5分泌促进TAM向M2型极化。

研究人员最后探究了伤害感受神经元介导的肿瘤-TDLN交互是否会影响免疫治疗的效果。在B16F10移植瘤模型中，PD-L1抗体单药治疗效果有限，但对TDLN-iNN进行化学抑制或敲除Calca后，抗肿瘤反应显著增强。此外，对口腔癌小鼠使用偏头痛药物Rimegepant（CGRP受体拮抗剂）治疗，可增强PD-L1抗体反应，同时缓解肿瘤诱发的疼痛。

图3 由伤害感受神经元介导的肿瘤-TDLN交互机制^[1]

这项研究揭示了一种由伤害感受神经元介导的肿瘤-TDLN交互机制。在TAM压力下，肿瘤细胞通过ATF4-SLIT2轴激活伤害感受神经元，后者则通过分泌CGRP将TDLN重塑为免疫抑制状态，减少CCL5分泌并促进TAM向M2型极化，最终促进肿瘤生长并降低免疫治疗效果。以伤害感受神经元或ATF4-SLIT2-CGRP轴为靶点进行干预，有望同时实现肿瘤控制和疼痛缓解，为增强免疫疗法提供了潜在策略。