Advanced Science：PCSK9/LIN28A/HES5/JMY 轴异常与神经管畸形

本研究前期从临床检测数据中发现PCSK9缺失与神经管畸形的发生密切相关，所以通过构建PCSK9敲除ESC和PCSK9 R46L点突变的iPSC（由赛业生物提供），分别结合三维神经类器官和二维神经祖细胞分化体系上，利用转录组测序筛选出关键分子JMY，并通过染色质免疫沉淀、荧光素酶报告基因等技术证实HES5转录激活JMY的表达机制。进一步通过免疫共沉淀和溶酶体抑制实验，揭示PCSK9作为分子伴侣介导LIN28A的溶酶体降解途径。并分别在细胞，类器官和斑马鱼模型中，通过基因敲降和过表达实验验证了LIN28A/HES5/JMY轴在神经管发育中的关键作用及表型可逆性。

通过对人脑类器官的单细胞数据分析，发现PCSK9在胚胎发育前两个月内高表达，随后迅速下降，后期几乎检测不到。该基因主要表达于顶端放射状胶质细胞（aRG），在部分中间祖细胞和深层投射神经元中低表达，而在其他神经元中极少表达，提示PCSK9在早期神经系统发育中起关键作用。

为探究其功能，技术人员构建了PCSK9基因敲除的胚胎干细胞（PCSK9⁻^/⁻ ESC），通过设计靶向第二外显子的gRNA，实现了11个碱基的缺失，导致移码突变及提前终止密码子，影响蛋白质功能结构域。敲除效果经Sanger测序和Western blot验证。

进一步利用神经类器官（NO）系统比较野生型（WT）与PCSK9⁻^/⁻ ESC的分化过程。结果显示，PCSK9⁻^/⁻ NOs整体形态较小，神经管（NT）结构发育不完全，周长和表面积均显著小于WT NOs。这些结果表明，PCSK9缺失会特异性影响神经管发育并导致类器官尺寸减小。

图1 PCSK9缺失导致NOs大小和NT结构改变

(A)不同发育时间点的人脑类器官中PCSK9表达和统计结果。(B)CRISPR/Cas9介导的PCSK9位点的缺失结果。(C)WT和PCSK9^-/- ESC中PCSK9的表达结果 (D)WT和PCSK9^-/- NO的代表性图像。(E)NO的直径、周长和表面积的量化结果。^[1]

对NOs横截面的免疫荧光染色分析揭示了其内部结构特征。通过SOX2与TBR1共标记，可区分NPCs与成熟神经元。NOs在三个区域形成类神经管（NT）结构：脑室区（VZ，富含NPCs）以及脑室下区/皮质板（SVZ/CP，富含成熟神经元）。在野生型（WT）NOs中，NT结构完整，成熟神经元（TBR1⁺、CTIP2⁺）均匀分布于NPCs周围；而PCSK9缺失导致成熟神经元减少、NPCs排列紊乱，并阻碍典型环状NT结构的形成。神经管闭合（NTC）失败是神经管畸形（NTDs）的重要原因，常伴随细胞骨架异常。鬼笔环肽染色显示，PCSK9⁻^/⁻ NOs中NT区域细胞排列混乱，微丝表达增强，符合NTC障碍特征。

为进一步验证PCSK9与NTDs的关联，构建了PCSK9 R46L突变体及VANGL2⁻^/⁻ iPSCs来源的NOs（其中PCSK9^R46L和VANGL2^-/- PSCs由赛业生物提供）。免疫荧光显示，两者均出现成熟神经元减少及环状NT结构缺失，表型与PCSK9⁻^/⁻类似。结合单细胞数据库分析，PCSK9在发育过程中主要定位于顶端放射状胶质细胞（aRG），属于NPCs亚群。WT NOs中PCSK9确实富集于SOX2⁺ NPCs区域，其缺失可能引起NPCs分化异常，导致结构畸形。为进一步探究细胞表型，将WT与PCSK9⁻^/⁻ ESCs诱导分化为NPCs进行培养。WT NPCs呈典型长梭形，而PCSK9⁻^/⁻ NPCs则表现为多分支、排列杂乱的异常形态，通常与细胞骨架紊乱相关。微丝染色进一步证实，PCSK9⁻^/⁻ NPCs结构混乱、分支增多，荧光强度增强，说明PCSK9缺失引起NPCs内细胞骨架结构异常。

图2 PCSK9缺失导致NPC中的细胞微丝紊乱

(A)NOs表现出三种不同的NT结构：心室、心室区 (VZ)和心室下区/皮质板SVZ/CP。(B)WT和 PCSK9^-/- NO中成熟神经元的免疫荧光染色结果。正方形表示NT结构，而白色圆形或不规则形状表示VZ区域。(C)异常NTC引起的NTD示意图。(D)WT和 PCSK9^-/- NO的NT结构中细胞微丝的免疫荧光染色结果。(E)荧光染色显示PCSK9在WT NO的NT结构中的定位和表达结果。(F)NPC诱导培养模型图。(G)WT 和PCSK9^-/- NPC的代表性光学结果。(H)WT和PCSK9^-/- NPC中细胞微丝的免疫染色结果。[1]

为解析PCSK9缺失引发NT结构异常的机制，研究人员进行了转录组测序分析。共鉴定出3764个差异表达基因（DEGs），其中2392个上调、1372个下调。GO富集分析显示，这些基因在“神经系统发育”等生物学过程，以及“细胞骨架蛋白结合”等分子功能和细胞组分中显著富集，提示PCSK9缺失主要影响神经发育和细胞骨架调控通路，与前期发现的细胞骨架异常导致NTDs相吻合。

进一步筛选出140个与细胞骨架组装相关的关键DEGs，其中肌动蛋白调控因子JMY表达上调最为显著。qPCR验证确认其表达变化具有统计学意义。JMY已知参与Arp2/3复合体介导的微丝成核，由此提出假设：PCSK9缺失通过上调JMY，改变Arp2/3复合体活性，破坏微丝网络，进而影响细胞形态。免疫荧光染色结果显示，在WT神经类器官（NOs）中，JMY正常定位并沿微丝分布；而PCSK9⁻^/⁻ NOs的NT结构闭合不全，JMY在细胞核与微丝中广泛高表达，并在NT结构缺口处异常聚集，伴随微丝信号增强。在NPCs层面，PCSK9⁻^/⁻组也呈现JMY高表达及多分支紊乱形态。后续功能回复实验证实，抑制JMY表达可有效挽救PCSK9缺失引起的表型：在PCSK9⁻^/⁻ NPCs中敲低JMY能改善其多分支形态；在NOs中敲低JMY则促进环状NT结构重建，恢复微丝正常分布，并提高成熟神经元标志物表达。综上，这些结果表明JMY是PCSK9缺失下游的关键效应分子，其失调通过破坏细胞骨架重塑，导致NT结构发育异常。

图3 PCSK9通过JMY调节NPC中微丝网络的形成来影响NT结构

(A)GO分析中与生物过程、分子功能和细胞成分相关的项目结果。(B)细胞骨架蛋白项目中所有DEG的热图。(C)改变基因的qPCR验证的统计结果。(D)细胞骨架蛋白的分子功能相关项目。(E,F)JMY和细胞微丝在NOs(E)和NPCs(F)NT结构上的表达和共定位的免疫荧光染色结果。(G)siJMY拯救实验后WT和PCSK9^-/- NPC中PCSK9和JMY蛋白水平的WB结果。(H,I)WT和PCSK9-/NPC中细胞微丝的免疫荧光染色结果。 (J,K)WT和PCSK9^-/- NT结构中细胞微丝的免疫荧光染色结果。[1]

基于转录组数据筛选出三个可能调控JMY的转录因子候选，其中HES5显示出最强的调控潜力。WB实验显示，在PCSK9⁻^/⁻组中HES5与JMY表达同步上升，提示HES5可能正向调控JMY。通过JASPAR数据库预测，发现HES5在JMY启动子区存在两个潜在结合位点（#1和#2）。ChIP实验证实HES5在#1位点处显著富集。荧光素酶报告基因实验进一步表明，过表达HES5可显著增强JMY启动子活性。为验证“PCSK9缺失通过HES5上调JMY”的假说，研究人员筛选出高效抑制的HES5 siRNA进行挽救实验。结果显示，抑制HES5可同时恢复JMY的表达水平并改善NPCs的异常形态。综上所述，PCSK9缺失通过转录因子HES5正向调控JMY的表达，进而参与神经发育过程中的基因表达调控与细胞形态维持。

图4 HES5作为转录因子调节JMY表达

(A)转录组数据库中FOXA3、HES5和ZNF460表达水平的热图。(B)WT和PCSK9^-/- NO中PCSK9、HES5 和JMY蛋白水平的WB结果。(C)HES5-JMY结合位点的预测。(D)JMY启动子两个位点HES5富集的ChIP-qPCR分析结果。(E)荧光素酶报告基因实验验证HES5表现出针对JMY的转录活性；(F)siHES5拯救实验后NPC中PCSK9、HES5和JMY蛋白水平的WB结果。(G)WT和PCSK9^-/- NPC中细胞微丝的免疫荧光染色结果。^[1]

既往研究表明，PCSK9可作为分子伴侣，通过溶酶体途径促进靶蛋白降解。基于此，我们推测PCSK9可能通过该途径调控HES5水平。为探索其机制，我们通过Co-IP联合质谱分析发现PCSK9与LIN28A存在相互作用，并在PCSK9缺失时内源性LIN28A水平显著上升。二级质谱及结构对接模拟进一步提示两者可能直接结合。在PCSK9⁻^/⁻ NPCs中，溶酶体内LIN28A减少，而细胞质及总LIN28A水平升高，提示PCSK9可能促进LIN28A的溶酶体降解。为进一步验证，我们分别使用CHX抑制蛋白合成和Baf-A1抑制溶酶体活性。结果显示，在CHX处理下，PCSK9⁻^/⁻组LIN28A降解减慢；而Baf-A1处理后两组LIN28A水平无差异，说明PCSK9确实通过溶酶体途径调控LIN28A稳定性。免疫荧光显示PCSK9与LIN28A及溶酶体标志物LAMP1存在共定位，且PCSK9缺失导致总LIN28A升高。后续功能回复实验表明，抑制LIN28A可改善PCSK9⁻^/⁻ NPCs的多分支形态，恢复NOs中微丝表达并促进NT结构环状重建，同时提高成熟神经元标志物水平。综上，PCSK9缺失通过减少LIN28A的溶酶体降解，进而上调HES5与JMY表达，破坏细胞骨架结构，最终导致神经管形态发生异常。

图5 PCSK9通过溶酶体途径促进LIN28A降解来影响NT结构

(A)PCSK9和LIN28A的Co-IP结果。(B)CHX处理后NPC的LIN28A蛋白水平的WB结果。(C)CHX和 Baf-A1处理后NPC的LIN28A蛋白水平的WB结果。 (D,E)NOs(D)和NPCs(E)NT中PCSK9、LIN28A和 LAMP1的免疫荧光结果。(F)siLIN28A救援后NPC 中PCSK9、LIN28A、HES5和JMY蛋白水平的WB结果。(G)siLIN28A救援的NPC中细胞微丝的免疫荧光染色结果。(H)抑制剂1632救援的下NT结构中的细胞微丝的免疫荧光染色结果。(I)NTD中PCSK9/LIN28A/HES5/JMY调节轴介导的细胞微丝网络组装改变的简化示意图。^[1]

在斑马鱼和哺乳动物中，PCSK9均在外胚层早期发育及神经发生阶段持续表达。为探究其功能，他们设计了靶向PCSK9第二外显子的反义吗啉寡核苷酸（MO），诱导25-bp缺失以抑制其表达。结果显示，PCSK9-MO纯合胚胎在48 hpf时出现神经管（NT）结构异常，RT-PCR证实其PCSK9转录水平显著下降。尽管PCSK9-MO单独处理仅引起23%（46/200）的神经管畸形（NTDs）发生率，但进一步实验发现，过表达JMY mRNA可单独诱导NTDs，并与PCSK9-MO产生协同作用：联合处理使NTDs发生率升高至38%（76/200），并伴随死亡率上升。组织切片显示，PCSK9-MO斑马鱼表现为神经管缩短、管腔扩张和神经丝紊乱，联合JMY过表达后这些表型进一步加剧。行为学分析表明，PCSK9-MO及JMY过表达均导致斑马鱼运动能力下降，表现为运动距离、速度和加速度的显著降低，而联合处理组上述参数下降更为明显。综上，斑马鱼模型中PCSK9缺失可导致神经管发育异常，而JMY过表达不仅单独诱发NTDs，还可协同增强PCSK9缺失所引起的表型严重程度与发生率。

图6 JMY加重了斑马鱼中PCSK9缺失引起的NTD

(A)针对斑马鱼第二外显子区域设计PCSK9-MO基础图。(B)PCSK9-MO、JMY-mRNA及其联合给药对斑马鱼NT发育的影响。(C)PCSK9-MO施用后PCSK9表达的RT-PCR检测结果。(D)PCSK9-MO、JMY-mRNA和联合治疗组中斑马鱼NTD的发病率和死亡率百分比。(E)给与JMYmRNA后JMY表达的RT-PCR检测结果。(F)PCSK9-MO、JMY-mRNA和联合给药组中斑马鱼活动的热图像。(G)PCSK9-MO、JMY-mRNA和联合给药组中斑马鱼相关行为的统计分析结果。[1]