【抗体小课堂】如何选择合适的抗体筛选技术平台？
如何选择合适的抗体筛选技术平台？
对于刚踏入抗体药物研发领域的从业者而言，常会遇到一个困惑：着手抗体开发时，既不确定“哪条抗体筛选技术路线更优”，也不清楚“哪种更适配实验室的实际需求”。而杂交瘤技术、噬菌体展示技术与单 B 细胞抗体筛选技术，正是抗体筛选领域的三大核心技术平台。由于三者在技术特点、成本投入、研发周期上存在差异，其适用场景也各有侧重。今天，抗体小课堂将带大家深入了解这三大平台，为后续的抗体筛选工作提供更具针对性的决策参考。
一、抗体筛选技术平台的实验流程概述
1.1 杂交瘤技术
1975年，Kohler 与 Milstein首次报道杂交瘤技术[1]，目前这项技术的策略是将小鼠骨髓瘤细胞与免疫后的小鼠B细胞融合，通过HAT选择性培养基筛选，形成的单克隆杂交瘤细胞兼具骨髓瘤细胞的无限增殖能力以及B细胞分泌抗体的能力，可以持续不断地产生大量针对单一抗原表位的单克隆抗体。
杂交瘤技术的实验流程就像一场接力赛，每个步骤都很关键，具体可概括为五个步骤[2]（图1）。
- 抗原免疫小鼠
- 取脾脏、分离B细胞
- B细胞与骨髓瘤细胞融合
- 阳性杂交瘤细胞的筛选
- 阳性杂交瘤细胞的扩增与单克隆抗体重组表达
图1 杂交瘤技术的流程示意图[2]
目前，主要有两种单克隆抗体扩增方法。一种方法是在培养瓶或生物反应器中进行体外培养单克隆杂交瘤细胞。经过几天的增值培养，收集细胞培养液上清并纯化后就能获得单克隆抗体。另一种是将单克隆杂交瘤细胞注射到预处理的小鼠腹腔中，1-2周后，小鼠腹腔会积累大量腹水，用注射器抽取腹水，从腹水中纯化单克隆抗体。若制备大规模、高纯度、治疗用抗体，一般首选体外扩增；若制备小规模、低成本、科研级抗体，则可考虑体内扩增，但需注意动物伦理与抗体纯化（表1）。
表1 杂交瘤技术扩增单克隆抗体的两种方式对比分析
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对比维度 |
体外扩增（取细胞上清） |
体内扩增（取腹水） |
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抗体纯度 |
高（杂质少） |
低（含大量动物蛋白、杂质） |
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操作复杂度 |
高（依赖设备和无菌操作） |
低（仅需动物注射技术） |
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成本 |
高（设备、培养基成本） |
低（动物饲养成本） |
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规模化能力 |
强（可升级至生物反应器） |
弱（依赖动物数量，难以大规模） |
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动物伦理 |
符合（无动物使用） |
争议大（涉及动物伦理） |
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核心应用场景 |
治疗用抗体、高纯度抗体需求、规模化工业生产 |
小规模、科研用抗体、体外难培养的杂交瘤细胞 |
1.2 噬菌体展示技术
1985年，Smith首次描述噬菌体展示技术[3]。噬菌体可展示不同类型的抗体形式，包括scFv、Fab、VHH[4]（图2.）。根据抗体基因多样性的来源，噬菌体展示抗体文库可分为天然文库、合成文库和半合成文库三种类型，这项技术的关键步骤是文库构建与淘选[5]（图3.）。
图2 噬菌体展示不同类型的抗体形式[4]
1.2.1 文库构建
将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因通过分子生物学技术克隆到噬菌体展示载体（常用噬菌粒）中，VH、VL基因与噬菌体外壳蛋白基因（如pIII）融合表达，以融合蛋白的形式展示在子代噬菌体表面，从而构建噬菌体展示文库。再用噬菌体侵染大肠杆菌。随着大肠杆菌的增殖，噬菌体文库也得以扩增。
1.2.2 固相淘选
分离、富集能够特异性结合目标抗原的噬菌体克隆：
（1）结合：将目标抗原固定在酶标板上，噬菌体展示文库铺在酶标板上，与目标抗原孵育一定时间后，使特异性噬菌体结合。
（2）洗涤：用缓冲液洗去未结合的游离噬菌体，减少非特异性结合。
（3）洗脱：以酸性缓冲液、竞争性抗原或胰酶脱下与目标抗原结合的噬菌体。
（4）扩增：洗脱下来的噬菌体侵染大肠杆菌，噬菌体进一步繁殖扩增。重复进行3-5轮的结合-洗涤-洗脱-扩增，最终与目标抗原特异性结合的噬菌体得到高度富集。应控制好噬菌体文库淘选的轮数，过度淘选会极大降低抗体分子的多样性。
1.2.3 鉴定与验证
（1）基因测序：提取噬菌体DNA，测序分析VH、VL的基因序列。
（2）功能验证：通过ELISA、BLI、中和实验等验证结合亲和力与中和作用。
（3）阳性克隆表达：筛选高亲和力克隆进行大规模表达。
图3 噬菌体展示技术的文库构建与淘选[5]
1.3 单B细胞抗体筛选技术
2008年，Tiller等人首次实现从人外周血中分选抗原特异性的单个B细胞，并结合单细胞RT-PCR技术克隆抗体可变区基因，可以直接从单个B细胞中筛选天然配对的特异性抗体[6]。自此，单B细胞抗体筛选技术进入了百花齐放的发展阶段。目前，主流的筛选技术与仪器设备主要基于三类原理：流式分选、液滴微流控分选和单细胞光导筛选。
1.3.1 流式分选（FACS）抗原特异性单B细胞
基于多色流式细胞分选仪可以筛选展示抗原特异性mIgG抗体的记忆B细胞。分选步骤一般包括
①分选IgD-IgM-IgG+B细胞；
②分选特异性B细胞（图4）。流式分选出的单B细胞可以混合NGS建库，也可以以单细胞导出至96孔板中，进行单细胞抗体可变区基因RT-PCR扩增。如果是单细胞抗体重轻链可变区扩增，则需要将分选出的单B细胞裂解，提取细胞内的RNA，再以提取的RNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成cDNA。用巢式PCR技术，对cDNA中的抗体基因可变区进行扩增，获得足量的抗体基因可变区片段。
图4 单B细胞流式分选流程示意图
1.3.2 液滴微流控分选抗原特异性单B细胞
基于液滴微流控技术，可实现对分泌抗原特异性IgG抗体的浆细胞的高通量筛选。首先，通过磁性分选（MACS）分离出CD138+浆细胞，将其与抗原磁珠及荧光二抗等试剂在液滴生成装置中共同包裹形成油包水液滴。随后，在37℃下孵育约2小时，使浆细胞分泌的抗体与抗原磁珠充分结合，并与荧光二抗形成“抗原-抗体-荧光二抗”复合物。最后，将液滴溶液注入微流控分选设备中，利用激光检测系统对带有荧光信号的液滴进行识别和分选（图5），将其收集至试管或96孔板中，以便后续进行抗体重链和轻链可变区基因的扩增。
图5 单B细胞液滴微流控分选示意图
1.3.3 单细胞光导筛选抗原特异性单B细胞
与液滴微流控分选技术类似，单细胞光导系统同样能够筛选出分泌抗原特异性IgG抗体的浆细胞。二者的主要区别在于，单细胞光导系统采用了一种集成超过10,000个微腔的芯片作为核心耗材，可在单细胞水平上对B细胞分泌的抗体进行多种功能分析，包括抗原结合、种属交叉反应性及阻断活性的检测[7]（图6）。总体而言，单细胞光导系统虽然在通量上低于液滴微流控技术，但其具备更强的实验灵活性和更广泛的应用类型，适用于更多样化的功能评价场景。
图6 单B细胞光导芯片筛选示意图[7]
二、抗体筛选技术平台的优势与局限分析
表2 杂交瘤技术的优势与局限
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优势 |
局限 |
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• 天然抗体配对，在宿主体内经过亲和力成熟的自然过程，具有高亲和力。 • 获得稳定的杂交瘤细胞系，便可长期冻存并用于持续、大规模地生产高纯度单克隆抗体，确保极高的批次间一致性。 • 前期研发成本相对较低，适用于开发科研用抗体。 |
• B细胞与骨髓瘤细胞融合效率在1%以下，大部分B细胞没有得到有效筛选。 • 实验操作复杂，需要多轮ELISA筛选及亚克隆，需要花费2-3个月时间。 • 筛选通量有限，难以应对高难度靶点（如免疫耐受性强或毒性高的抗原），候选抗体的多样性较低。 • 受限于骨髓瘤细胞种类，目前还不能用于兔抗、羊驼纳米抗体筛选。 |
表3 噬菌体展示技术的优势与局限
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优势 |
局限 |
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• 不需要反复免疫与建库，噬菌体展示抗体库建成后可永久保存。 • 可直接构建和筛选人源抗体库，规避抗体的免疫原性问题，无需后续人源化。 • 库容量大、制备简单、低成本、高通量。 • 周期相对较短，1-1.5个月。 |
• 对文库质量、多样性、筛选方法的要求较高。 • VH、VL随机组合，难以保持抗体的天然配对，可能影响抗体活性。 • 未经过体内亲和力成熟、天然修饰的过程，抗体亲和力受限。 • 淘选过程中易于富集亲和力中等但表达量高的克隆，可能错失高亲和力但低表达的珍贵克隆。 |
表4 单细胞抗体筛选技术的优势与局限
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优势 |
局限 |
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• 基于抗原结合或表面标记（如CD138、CD19及CD27）精准筛选单B细胞。 • 快速分选大量单B细胞，实现高通量筛选，提高发现针对特定表位或具有罕见功能的稀有抗体克隆的概率。 • 天然抗体配对，确保抗体的高亲和力、高特异性和良好的生物学功能。 • 周期相对更短，1-2周。 |
• 设备昂贵，费用高。 • 技术难度大，操作复杂。 • 需要高质量样本。 • 针对B细胞标记物的抗体并非适用于所有物种。 |
三、抗体筛选技术路径的选择建议
抗体筛选技术路径的选择应当基于项目的核心筛选目标和资源约束条件进行综合判断，以下提供一个基本的策略，遵循“目标导向–资源匹配–整合优化”的原则，分3步执行。
3.1 明确核心筛选目标
3.1.1 抗体的应用场景
（1）科研用抗体：若目标是开发用于Western Blot、IHC、ELISA、Flow Cytometry等实验的工具抗体，研究蛋白互作、细胞通路等课题，一般筛选路径首选杂交瘤技术，因其低成本、高效益，能够提供稳定供应的抗体用于长期、重复性的实验。其产生的天然全长抗体具有良好的生物学功能，对于大多数学术实验室而言，杂交瘤技术是比较经济与可靠的选择。若需要研究特定免疫应答（如感染或疫苗接种后）中B细胞库的多样性，或需要快速获得针对新靶点的抗体时，单B细胞抗体筛选技术则能够为科研人员提供独特的视角。
（2）诊断用抗体：开发用于体外诊断（IVD）试剂盒的抗体，要求抗体具有高特异性、高亲和力、高灵敏度、批次间一致性和可规模化生产能力。噬菌体展示技术在诊断试剂的工程化改造中作用突出，便于将抗体片段与酶、荧光素等报告分子融合，实现基因层面的定向改造。
（3）治疗用抗体：开发治疗用抗体的核心诉求是获得高亲和力、低免疫原性、高特异性、高稳定性的人源化抗体、全人源抗体，基于这些诉求，噬菌体展示技术、单B细胞抗体筛选技术都是不错的选择。如果预算充裕、要求实验周期尽可能短，则建议选择单B细胞抗体筛选技术；如果预算有限、对实验周期要求不太严格，则建议选择噬菌体展示技术。
3.1.2 抗体来源要求
（1）鼠源抗体、嵌合抗体：大多选择杂交瘤技术进行抗体筛选。当项目要求是“快速、低成本获得特异性抗体”，且应用场景为非临床治疗（如科研、体外诊断）时，优先选择鼠源抗体；当项目要求是“抗体需在人体内发挥治疗作用”，且需平衡“特异性”与“安全性”时，或作为“鼠源抗体向人源化抗体过渡的研发中间产物”时，选择嵌合抗体。
（2）人源化抗体、全人源抗体：对于注射到人体内的治疗用抗体，为了降低抗体的免疫原性，需要直接从人B细胞或人源抗体库中筛选人源化抗体、全人源抗体，通常采用单B细胞抗体筛选技术、噬菌体展示技术。科研人员可综合考虑这两种技术的优势与局限，选择合适的技术路径。
3.1.3 功能需求
（1）需特异性结合（如诊断用抗体）：优先采用噬菌体展示技术（低成本、高通量）；需优化筛选条件，提高特异性，减少非特异性结合。
（2）需功能活性（如中和、调理、内化等）：优先采用单B细胞抗体筛选技术（筛选天然功能抗体）；需协同设计合适的功能筛选实验，确保筛选到的抗体具有所需功能。
（3）需穿透细胞或组织：优先选择噬菌体展示技术（可筛选体积小、穿透力强的抗体）；需优化抗体结构，提高穿透能力和稳定性。
3.2 评估资源约束
3.2.1 客户群体的项目需求与周期、成本的约束
（1）生物医药企业：这类客户群体的经费相对充裕，更关注开发速度、专利壁垒和工艺可放大性，需要快速产出抗体药物，使得单B细胞抗体筛选技术成为主流选择，其核心价值在于：保留天然VH-VL配对，降低临床免疫原性风险；开发周期压缩至传统方法的1/3；直接获得基因序列，便于专利保护。建议采用“双平台并行”模式：初期通过噬菌体展示快速获得先导分子（1-2个月），同时启动单B细胞筛选获得高亲和力候选抗体，提高管线成功率。
（2）高校和科研院所：这类客户群体通常面临经费有限、设备共享、人员流动性大等资源约束，学术研究人员仍普遍采用杂交瘤技术用于抗体筛选，因其仅需基础细胞培养设备（CO₂培养箱、显微镜等），实验材料成本低廉，但需考虑时间成本和人力成本，平衡总成本。客户也可考虑噬菌体展示文库技术，将基因文库构建和淘选工作委托给生物技术公司，初期的文库构建成本较高，一旦文库构建完成，后期的筛选成本相对较低。客户在高校和科研院所内仅需完成表达验证，从而大幅降低技术门槛。
3.2.2 技术复杂度的约束
（1）低复杂度：实验人员具备基本的分子生物学和免疫学知识，就可以选择杂交瘤技术，操作相对简单，更容易掌握技术要点。
（2）中等复杂度：实验人员需要具备较强的专业知识和实验技能，可以采用噬菌体展示技术。
（3）高复杂度：需要由生物技术公司对实验人员进行专业的技术培训，组建技术团队，面向客户提供单B细胞抗体筛选技术服务。
3.3 路径整合与优化
现代抗体开发很少依赖于单一平台，往往是组合拳。单一的抗体筛选技术难以覆盖所有需求，需根据筛选阶段采用合适的技术组合。
（1）初筛阶段：目标是从大量候选抗体中快速筛选出具有初步结合能力的抗体，应选择高通量、高效率、高库容、低成本的技术组合，同时处理大量候选抗体，快速缩小筛选范围，一般采用噬菌体展示技术（筛选高亲和力）+ELISA（快速排除阴性克隆）。
（2）复筛阶段：目标是从初筛得到的候选抗体中进一步筛选出高亲和力、高特异性的抗体，应选择高精度、高可靠性的技术组合，一般采用噬菌体展示技术（筛选高亲和力）+WB（筛选高特异性）。
（3）终筛阶段：目标是从复筛得到的候选抗体中确定最终的目标抗体，并进行全面的功能验证，应利用噬菌体展示技术搭配全面的功能验证实验，对候选抗体进行体外活性分析（如ADCC、CDC、细胞增殖抑制实验、细胞因子释放实验、内化作用检测）。
四、总结
抗体筛选技术正处于快速迭代与融合创新的阶段，杂交瘤、噬菌体展示、单 B细胞抗体筛选三大核心平台各有适配场景，无绝对“最优路径”，唯有紧扣项目目标（如抗体类型、功能需求）与资源约束（如成本、周期、技术门槛）的选择，才能实现效率最大化。未来，通过多技术平台的整合优化（如初筛用噬菌体展示提效、终选用单B细胞抗体筛选保活性），并结合AI 辅助设计等前沿技术，将进一步突破抗体筛选瓶颈，为疾病机制研究、临床诊疗方案升级提供更坚实的技术支撑。
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参考文献
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- Aboul-Ella H, Gohar A, Ali A A, et al. Monoclonal antibodies: From magic bullet to precision weapon[J]. Molecular Biomedicine, 2024, 5(1): 47.
- Smith G P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J]. Science, 1985, 228: 1315-1317.
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