三种方法各有优缺点：

（1）慢病毒法

通过将含有引导分子和核酸酶基因的慢病毒感染目的细胞株，通过筛选，获得稳定的转染细胞株。在细胞内，引导分子和核酸酶结合成剪切复合体，被转运进入细胞核，以完成对目的基因的剪切，从而达到基因敲除的目的，慢病毒感染存在着两个比较关键的问题：

①利用慢病毒法转染会在敲除靶基因的同时引入新的基因，而且慢病毒转染的外源基因是随机整合，存在影响其他基因表达的风险。

②慢病毒法会持续表达，长期存在的核酸酶会对这种脱靶效应有累积效应，最终影响实验严谨性。

（2）质粒法：通过将含有引导分子和核酸酶基因表达载体瞬时转染到目的细胞中，从而在细胞内表达引导分子和核酸酶，由于质粒（非整合型质粒）整合到基因组的概率极低，随着细胞传代质粒的逐新消失，再经过PCR验证和测序筛选出纯合的敲除细胞。但质粒法也存在一个较大的问题，即转染效率较低。

（3）RNP法：与质粒法不同的是，RNP法是通过电刺激转染的方法直接将引导分子和核酸酶复合物转染到细胞中。由于核酸酶是不带电荷的，而引导分子是带电荷的，因此只有当引导分子和核酸酶结合后，才能更高效的将两者转染到细胞中。同时，由于引导分子和核酸酶会被降解，引导分子和核酸酶复合物在细胞内的存留时间不会很长，因此发生脱靶的概率很低，与其他两种相比，高效，快捷，无残留。