可能的原因有：

1. Western Blot抗体的选择不合适

2. 基因的可变剪切引起的蛋白残留

3. 由于目的基因的多转录本引起的蛋白残留

4. 目的蛋白本底表达低

5. 遗传补偿效应：无义突变和同源序列

参考Western blot trouble shooting思路图进行原因排查：

👉细胞和基因信息分析

1. 确保细胞和基因的准确性。

2. 核对敲除策略和引导分子设计位置，确保引导分子设计在保守区域且尽可能覆盖所有转录本。

3. 分析目的基因是否有同源基因，如有同源基因可能会存在遗传补偿效应。

4. 分析目的基因在宿主细胞内的本底表达水平，相应调整Western blot参数。

👉DNA水平分析

1. 检查鉴定策略是否合适，PCR电泳条带与预期是否一致。

2. 核查测序原始数据，测序质量是否合格，分析测序结果检查是否还有未敲除干净的序列，与野生型序列进行比对确保敲除成功。

👉mRNA水平分析

两种方法可以在mRNA水平进行验证：

1. 使用赛业生物RDDC软件对突变进行可变剪切预测，如产生移码和提前终止，则认为mRNA水平敲除合格。

2.提取细胞mRNA进行cDNA PCR和测序，并与野生型进行比对，确定mRNA水平是否敲除成功。

👉蛋白水平分析

根据DNA测序结果，使用相应软件将KO后的DNA翻译成氨基酸序列，并与野生型氨基酸序列进行比对，确定氨基酸水平是否发生敲除。

👉抗体分析

KO验证和文献验证更优，比对抗体免疫原位点与敲除区域位点，免疫原位点C端优于N端，核对抗体是单克隆或者多克隆，单克隆优于多克隆；抗体的品牌，进口优于国产。