方法一
使用 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit (Ver.5.0_Code No. 9765) 来提取鼠尾基因组DNA。
准备工作:
1. 备好无水乙醇。
2. WB使用前需要加入65mL的无水乙醇(试剂盒推荐56mL,我们经过长期数据显示,加入65mL提取的基因组纯度更高)。
3. Buffer GL若出现沉淀,请于56℃加热溶解,待恢复至室温后使用。
4. 洗脱膜上的DNA时,用0.25X TE buffer洗脱的DNA保存时间更持久;使用前放置56℃预热,DNA洗脱效率更高。
实验流程:
1. 每个装有样品的EP管中加 180μL Buffer GL, 20μL 蛋白酶K(用试剂盒里的蛋白酶K加20μL 即可,该浓度是20mg/mL),10μL RNA酶。(注意:鼠尾不能太长,一般2~5mm;如果鼠尾实在过粗,可以增大裂解体系至300μL)。
2. 放置56℃ 烘箱过夜反应(一般12~16个小时)。
3. 第二天早上从烘箱取出样品放置离心机里,12000rpm离心2分钟,将毛发杂质离到管底。
4. 吸取上清至另一干净的EP管中(注意尽量不要吸到管底的毛发和杂质),再加入200μL Buffer GB 和 200μL的无水乙醇,盖好盖子后上下颠倒混匀。
5. 混匀后将液体转移至准备好的吸附柱中,12000rpm离心2分钟;弃滤液。
6. 向吸附柱中加入500μL Buffer WA,12000rpm离心1分钟;弃滤液。
7. 吸附柱的管壁四周加入700μL Buffer WB ,静置1分钟,再12000rpm离心1分钟;弃滤液;(注意:一定要保证WB中已经加过了指定体积的无水乙醇;沿着吸附柱管壁四周加入WB,有助于完全冲洗沾附管壁上的盐份。)
8. 重复操作步骤7,弃滤液.
9. 空甩: 12000rpm 离心2分钟。
10. 将吸附柱放置在一个新的1.5mL的离心管上,盖子开着,室温放置10分钟,以去除残留的乙醇;(注意:乙醇残留会抑制聚合酶扩增)。
11. 向吸附柱膜的中央加入50μL 预热过的0.25X TE buffer,盖好盖子后室温静置10分钟;(注意:预热的灭菌水可以提高洗脱效率)。
12. 12000rpm 离心2分钟洗脱DNA;可以将离下的液体再次加入膜中央,再静置5分钟,再12000rpm 离心2分钟,获得浓度更高的DNA。
13. 将获得DNA测浓度,也可以通过电泳观察纯度。
方法二:
使用粗裂的方法获得鼠尾基因组DNA(适用于扩增<1kb的条带)。
Triton裂解液的配制:(1L量)
1. 分别用电子天平称取下列物品至烧杯:
KCl:3.7g
Tris:1.2g
2. 加入300~400mL灭菌水溶解。
3. 加入1mL TritonX-100,充分溶解,若不能充分溶解可以放入56℃烘箱中溶解。(TritonX-100呈油状液体,注意吸取前先润洗移液器,注意打尽TritonX-100后才能把枪头伸到溶液中反复吹吸,否则很容易使得TritonX-100大量残留在枪头内壁上)。
4. 加入80μL浓盐酸调pH至9.0。
5. 然后用灭菌水定容至1L后,室温保存,待用。
注意:TritonX-100高压灭菌后会产生大量沉淀,请勿高压灭菌。(用不同的颜色标示)
样品的裂解:
1. 取鼠尾或者鼠爪(~2mm)至EP管,加入98μL裂解液+2μL 20mg/mL的蛋白酶K(注:鼠尾不可超过3mm,不然裂解不充分,若鼠尾过粗,可以适量增加裂解液的量;蛋白酶K需要注意不要反复冻融,不然会影响活性)。
2. 加了裂解液和蛋白酶K后,将EP管放入56℃烘箱或者水浴锅,过夜运行;
第二天从烘箱中取出样品,放置金属浴或者PCR仪中,98℃反应15分钟,目的是使蛋白酶K失活。
3. 之后将样品离心15分钟,上清即可作为PCR模板。(一般25μL的PCR体系中,可以加入1.5μL的上清)。