CAR分子设计和慢病毒制备
CAR分子设计
CAR分子全称为嵌合抗原受体，其结构包括信号肽分子，抗体来源的单链可变区、铰链区、跨膜区，共刺激分子结构域，CD3ζ信号转导域。
scFv筛选
scFv亲和力和特异性对CAR分子功能有重要影响，筛选合适的scFv十分重要。
连接基团（Linker）的优化
设计不同长度的Linker，使VH和VL之间的灵活度增加，进而影响结合亲和力。
铰链区（Hinge）的优化
设计不同长度的Hinge，增加抗原结合域的空间灵活度。
共刺激结构域的选择
可选择不同的共刺激分子（如4-1BB或CD28等）。
报告基因
可连接绿色荧光蛋白基因，表征CAR分子是否转导成功。
图1. CAR分子结构示意图
CAR分子设计中常用原件
| 分类 | 来源 | 功能 | 表达部位 |
|---|---|---|---|
| 信号肽分子 | CD8α、GM-CSF等 | 引导CAR分子上膜 | 胞外 |
| 抗体scFv | 专利、文献、抗体开发 | 靶向识别肿瘤抗原 | 胞外 |
| 铰链区 | CD8α、IgG1、IgG4、IgGD等 | 维持scFv同细胞膜间的相对空间构象 | 胞外 |
| 跨膜区 | CD8α、CD28、CD4等 | 锚定CAR分子膜表达 | 跨膜 |
| 共刺激分子 | 4-1BB、CD28、CD27、ICOS等 | 提供T细胞活化第二信号 | 胞内 |
| 信号转导分子 | CD3ζ | 提供T细胞活化第一信号 | 胞内 |
载体构建
在设计好CAR分子后，通常需要对其进行基因合成并亚克隆至慢病毒穿梭质粒上，构建后的其结构通常如图所示。此外，赛业还可以提供多种现货型的CAR慢病毒质粒载体库，靶点包括人的CD19、BCMA、GPC3、FAP和HER2等，且该载体库还在不断的丰富和更新中。
图2. CAR慢病毒载体结构图示
病毒包装和纯化
赛业在慢病毒制备方面具有多年的经验，可以提供多样化的慢病毒制备服务。赛业使用安全性高的第三代慢病毒包装系统，其制备流程如图所示。
图3. 慢病毒包装技术路线
CAR分子设计和慢病毒制备服务项目
- CAR分子设计及载体构建
- CAR慢病毒制备
- 靶抗原稳转细胞株构建
交付物：载体构建报告、慢病毒质检报告、慢病毒浓缩液
客户需要提供信息：
靶点抗原信息、抗体scFv序列（可选）、CAR分子结构信息、所需载体信息
CAR分子设计和慢病毒制备服务优势
- 丰富的CAR慢病毒质粒载体库，可提供快速优质的服务
- 抗原高表达、高稳定性的稳转细胞株构建服务
- 高滴度高纯度的慢病毒制备
- 严格的质控标准
CAR分子设计和慢病毒制备服务案例
CD19抗原慢病毒滴度检测
将表达CD19抗原的慢病毒纯化液进行梯度稀释（0.01、0.1、1、10μL四个梯度），分别加入到相同数量的293T细胞中，72小时后流式检测293T细胞阳性率（即被慢病毒感染的293T细胞占细胞总数的百分比），进而计算慢病毒的转导滴度。
如图所示，CD19抗原阳性细胞的数量随转染病毒梯度的增加而逐渐升高，表明该慢病毒有良好的感染活性，并计算病毒滴度为：1.4×10^8 TU/mL。
图4. CD19抗原慢病毒滴度检测结果
CD19-293T稳转细胞株构建
使用上述CD19抗原慢病毒转染293T细胞，经过多轮筛选，得到CD19抗原高度均一表达的CD19-293T稳转细胞。
图5. CD19-293T细胞CD19抗原阳性率检测结果
FMC63 CAR慢病毒滴度检测
我们设计了如下结构的靶向CD19抗原的FMC63 CAR分子，并将其构建慢病毒载体上，进行慢病毒制备。采用上述方法检测FMC63 CAR慢病毒滴度，病毒滴度约为：4.33×10^8 TU/mL。
图6. FMC63 CAR分子结构
图7. FMC63 CAR慢病毒滴度检测结果
