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CAR分子设计和慢病毒制备

CAR分子设计

CAR分子全称为嵌合抗原受体,其结构包括信号肽分子,抗体来源的单链可变区、铰链区、跨膜区,共刺激分子结构域,CD3ζ信号转导域。
scFv筛选
scFv亲和力和特异性对CAR分子功能有重要影响,筛选合适的scFv十分重要。
连接基团(Linker)的优化
设计不同长度的Linker,使VH和VL之间的灵活度增加,进而影响结合亲和力。
铰链区(Hinge)的优化
设计不同长度的Hinge,增加抗原结合域的空间灵活度。
共刺激结构域的选择
可选择不同的共刺激分子(如4-1BB或CD28等)。
报告基因
可连接绿色荧光蛋白基因,表征CAR分子是否转导成功。
图1. CAR分子结构示意图

CAR分子设计中常用原件

分类来源功能表达部位
信号肽分子
CD8α、GM-CSF等
引导CAR分子上膜
胞外
抗体scFv
专利、文献、抗体开发
靶向识别肿瘤抗原
胞外
铰链区
CD8α、IgG1、IgG4、IgGD等
维持scFv同细胞膜间的相对空间构象
胞外
跨膜区
CD8α、CD28、CD4等
锚定CAR分子膜表达
跨膜
共刺激分子
4-1BB、CD28、CD27、ICOS等
提供T细胞活化第二信号
胞内
信号转导分子
CD3ζ
提供T细胞活化第一信号
胞内

载体构建

在设计好CAR分子后,通常需要对其进行基因合成并亚克隆至慢病毒穿梭质粒上,构建后的其结构通常如图所示。此外,赛业还可以提供多种现货型的CAR慢病毒质粒载体库,靶点包括人的CD19、BCMA、GPC3、FAP和HER2等,且该载体库还在不断的丰富和更新中。
图2. CAR慢病毒载体结构图示

病毒包装和纯化

赛业在慢病毒制备方面具有多年的经验,可以提供多样化的慢病毒制备服务。赛业使用安全性高的第三代慢病毒包装系统,其制备流程如图所示。
图3. 慢病毒包装技术路线

CAR分子设计和慢病毒制备服务项目

  • CAR分子设计及载体构建
  • CAR慢病毒制备
  • 靶抗原稳转细胞株构建
交付物:载体构建报告、慢病毒质检报告、慢病毒浓缩液
客户需要提供信息: 靶点抗原信息、抗体scFv序列(可选)、CAR分子结构信息、所需载体信息

CAR分子设计和慢病毒制备服务优势

  • 丰富的CAR慢病毒质粒载体库,可提供快速优质的服务
  • 抗原高表达、高稳定性的稳转细胞株构建服务
  • 高滴度高纯度的慢病毒制备
  • 严格的质控标准

CAR分子设计和慢病毒制备服务案例

CD19抗原慢病毒滴度检测

将表达CD19抗原的慢病毒纯化液进行梯度稀释(0.01、0.1、1、10μL四个梯度),分别加入到相同数量的293T细胞中,72小时后流式检测293T细胞阳性率(即被慢病毒感染的293T细胞占细胞总数的百分比),进而计算慢病毒的转导滴度。
如图所示,CD19抗原阳性细胞的数量随转染病毒梯度的增加而逐渐升高,表明该慢病毒有良好的感染活性,并计算病毒滴度为:1.4×10^8 TU/mL。
图4. CD19抗原慢病毒滴度检测结果

CD19-293T稳转细胞株构建

使用上述CD19抗原慢病毒转染293T细胞,经过多轮筛选,得到CD19抗原高度均一表达的CD19-293T稳转细胞。
图5. CD19-293T细胞CD19抗原阳性率检测结果

FMC63 CAR慢病毒滴度检测

我们设计了如下结构的靶向CD19抗原的FMC63 CAR分子,并将其构建慢病毒载体上,进行慢病毒制备。采用上述方法检测FMC63 CAR慢病毒滴度,病毒滴度约为:4.33×10^8 TU/mL。
图6. FMC63 CAR分子结构
图7. FMC63 CAR慢病毒滴度检测结果