Nucleic Acids Research
酵母TLC1长链非编码RNA的3′端加工机制研究

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端粒酶（telomerase）是维持染色体末端稳定性的关键核糖核蛋白复合物，其RNA组分TLC1在酵母中以约29个拷贝每细胞的低丰度表达，其表达水平与端粒长度调控密切相关。TLC1的成熟过程涉及转录终止、3′端加工、核质转运和Sm蛋白环结构的组装等复杂步骤。传统上，长链非编码RNA的转录终止主要通过两种机制：CPSF–CF介导的多聚腺苷酸化（poly(A)）信号（PAS）依赖途径和Nrd1–Nab3–Sen1（NNS）途径。NNS途径通常通过识别RNA中的特定序列，介导RNA解旋酶Sen1结合RNAPII并终止转录，而CPF–CF则负责大多数mRNA和少数lncRNA的3′端加工并添加保护性poly(A)尾。然而，TLC1的转录终止机制存在争议，有研究认为其终止依赖于NNS途径，但缺乏体内直接证据。本研究通过系统性突变分析和RNA结构预测，重新评估了TLC1的3′端加工机制，提出CPF–CF复合物是主要加工系统，而Nrd1–Nab3则参与核内质量控制，防止过长转录本的异常泄漏。

本研究通过突变分析和RNA结构预测，系统地研究了酵母TLC1 RNA的3′端加工机制。首先，作者构建了Nrd1和Nab3结合位点突变的菌株（N1*和N01*），并通过RIP实验证实这些突变显著降低了Nrd1与TLC1的结合，同时qPCR和Northern blot分析显示，突变株中TLC1的成熟和未成熟转录本均增加，但未导致端粒缩短。进一步3′端PCR分析表明，所有检测的TLC1转录本均来源于CPF–CF介导的加工，而NNS终止途径并未显著参与。为了研究转录后加工对端粒功能的影响，作者在TLC1中引入了多个PAS位点突变，并分析其转录本的长度变化和亚细胞定位。结果显示，主要PAS位点突变导致较长的3′端延伸，而这些转录本的核质转运效率降低，影响端粒酶功能。结构预测显示，野生型TLC1的poly(A)尾部可以形成发夹结构，利于Sm蛋白结合和核再导入，而过长的TLC1转录本则因结构异常无法有效结合Sm环，导致核导入缺陷和功能失活。此外，作者还发现Nrd1和Nab3在核内监控过长转录本的稳定性，这一过程独立于Sen1，确保只有正确加工的TLC1进入细胞质进行成熟。最后，通过引入T-stretch缺失突变，研究进一步确认了RNA二级结构对核质转运和端粒酶活性的重要性。这些结果共同表明，TLC1的3′端加工是一个高度调控的过程，CPF–CF和Nrd1–Nab3竞争结合不同长度的转录本，确保只有正确加工的RNA进入核质循环，维持端粒酶功能。

本研究推翻了先前关于TLC1依赖NNS途径进行转录终止的模型，证实其3′端加工主要由CPF–CF复合物介导，且该加工产生的poly(A)尾部对RNA折叠和Sm环结合至关重要。过长的TLC1转录本因结构异常无法有效结合Sm蛋白，导致核导入失败，最终被细胞质质量控制系统降解。同时，Nrd1和Nab3在核内监控过长转录本的稳定性，通过独立于Sen1的机制促进异常转录本的降解。这些发现揭示了一个新的RNA质量控制机制，其中CPF–CF和Nrd1–Nab3竞争结合RNA，决定其稳定性或降解命运，为ncRNA成熟和功能调控提供了重要线索。