AAV在皮肤组织研究中的靶向策略，AAV血清型选择有哪些？

皮肤作为人体最大的器官，是一个高度组织化的多功能复合体系。它并非简单的单层屏障，而是由表皮、真皮、皮下组织及一系列附属结构精密组装而成的动态界面，承担着屏障保护、感觉感知、体温调节、免疫监视及水分保持等不可或缺的生理功能。理解其复杂的层级结构，是实现在皮肤中进行基因靶向治疗与功能调控的解剖学基础。

 

表皮（Epidermis）是机体防御的最前线，位于最外层的复层鳞状上皮，其主要功能是提供一道坚固的物理、化学及免疫屏障。角质形成细胞构成表皮的主体（90%以上），另外还含有黑色素细胞、朗格汉斯细胞等。

 

真皮（Dermis）是结构支撑与信号枢纽，位于表皮之下，富含成纤维细胞（分泌胶原蛋白）、血管内皮细胞、毛囊、皮脂腺及免疫细胞等。不同的研究目的需要将基因精准递送至不同层级的特定细胞。例如，治疗遗传性大疱性表皮松解症需靶向基底层的角质形成细胞；改善皮肤纤维化或疤痕需靶向真皮成纤维细胞；而调控炎症或血管功能则可能涉及免疫细胞或内皮细胞。

 

皮下组织（Hypodermis）是真皮深部的疏松结缔组织和脂肪层。由脂肪细胞构成脂肪小叶，是机体的主要能量储存库和重要的内分泌器官，分泌多种脂肪因子。另外还含有纤维隔与血管网等。

 

皮肤这种由多层异质性组织、多样化的细胞类型以及高度特化的附属结构所构成的复杂空间格局，使得系统性注射的AAV很难高效富集于皮肤，而局部给药又难以穿透角质层并到达深层靶细胞。

 

图1：皮肤组织基本结构（来源：GeeksforGeeks）

 

腺相关病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）因其安全性高、免疫原性低、可实现长期基因表达等特点，已成为皮肤组织基因治疗和功能研究中最具前景的载体工具。成功的皮肤组织靶向策略依赖于血清型选择、启动子优化、给药途径三者的精密配合。

 

一. AAV血清型的选择

不同AAV血清型对组织有其天然亲和力，不同血清型对皮肤各类细胞的亲和力存在显著差异，需根据靶细胞类型进行筛选。

 

目前研究表明，经改造或天然存在的某些AAV血清型对皮肤组织展现出潜力。AAV5和AAV8对表皮层（尤其是角质形成细胞）显示出较高的转导效率，是真皮感染的有效工具；经过工程化改造的AAVDJ通常能够介导基因在皮肤组织中实现高效、广泛的递送。

 

Sundeep G Keswani[1]等研究者通过在C57BL/6J小鼠背部创建了双侧8mm全层皮肤切除伤口模型，以1×10¹¹ vg/鼠的注射剂量系统比较了由CMV启动子驱动的AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8注射28天后对皮肤伤口中不同细胞层的靶向转导效率。在表皮细胞中，AAV2/5有效转导80.3%的表皮细胞（包括基底和基底上角质形成细胞）；AAV2/8有效转导64.3%的表皮细胞，主要局限于基底上角质形成细胞，转导效率为：AAV2/5 > AAV2/8 >> AAV2/2 ≈ AAV2/7。在真皮细胞中，各血清型转导效率均较低，转导效率为：AAV2/5 > AAV2/8 >> AAV2/2 ≈AAV2/7。在皮下肉膜肌层中，AAV2/8 和 AAV2/7 对小鼠皮下特有的肉膜肌层具有极高的靶向性，转导效率分别达到91.2% 和83.6%，转导效率为：AAV2/8 ≈ AAV2/7 > AAV2/2 >> AAV2/5。

 

图2：不同血清型皮肤伤口中的转导效率[1]

 

Masakazu Kurita[2]等研究者通过皮下注射的方式，在小鼠背部皮肤隔离溃疡模型中对比了18种由CAG启动子驱动表达eGFP的AAV血清型基因递送效率，注射一周后对皮下组织的GFP信号进行检测，发现AAVDJ在局部溃疡处的皮肤组织转导效率最高，优于包括AAV2和AAV5在内的多种血清型。

 

图3：注射后一周不同血清型对皮肤组织转导效率[2]

 

值得注意的是，不同野生型AAV对皮肤各细胞层（表皮、真皮、肌肉）的感染效率并非一致，其差异主要由衣壳的天然趋向性决定，并高度依赖于具体的应用场景（如注射方式、注射剂量、检测时间等）与实验模型。例如Sundeep G Keswani[1]等使用急性、标准化的皮肤切口模型，研究聚焦于基因向表皮和真皮细胞的递送效率，结果表明，AAV5在该模型中对表皮（尤其是基底层）和真皮细胞的转导效率显著优于AAV2及所测试的其他野生型血清型；而Masakazu Kurita[2]等使用慢性、封闭性的皮肤溃疡模型，研究目标是在复杂伤口微环境中重编程间充质细胞以实现皮肤再生，在此条件下，经过人工定向进化改造的嵌合型AAV-DJ，其局部转导效率超越了包括AAV5在内的多种自然血清型。

 

综上，这两项研究的对比清晰地表明：不存在一种适用于所有场景的“最优”AAV血清型。AAV5在常规皮肤基因递送中表现出色，而面对如慢性伤口再生等复杂病理生理过程时，AAV-DJ可能展现出更优的靶向与递送效能。选择何种载体，必须根据研究的具体目标、靶细胞类型及疾病模型来审慎决定。

 

二. 特异性启动子的选择

选择细胞特异性启动子是实现精准靶向、避免脱靶表达、增强治疗安全性的核心手段。

 

• 角质形成细胞特异性启动子

Qi Shen[3]等研究者为提升基因递送至表皮角质形成细胞（KCs）的效率与特异性，在开发新型衣壳AAVDJK2的同时，优化了组织特异性启动子。以人KRT14（K14）基因的调控元件为基础，构建了包含全长K14启动子、缩短版的K14启动子（K14 short），以及一种新型杂交启动子K14 SCP3（由K14增强子与工程化核心启动子SCP3组成）在内的多种启动子载体。实验结果表明，K14 SCP3启动子在角质形成细胞中实现了最佳的基因转导效率，同时其在小鼠脂肪来源基质细胞（mASCs）中的表达维持在相对较低水平，在mKCs中的转导效率表现为：K14 SCP3 > CAG > K14 short > K14（图4）；在体内实验中，以1×10¹¹ vg/鼠的注射剂量，通过皮内注射分别携带CAG启动子和K14 SCP3启动子的AAVDJK2-GFPNLS至小鼠背部皮肤，发现使用K14 SCP3启动子能在不显著损失CAG启动子原有表达效率的前提下，更准确地局限于表皮基底层的KRT14阳性角质形成细胞中，显著增强基因表达在表皮层的特异性（图5）。

 

图4：K14 SCP3启动子增强体外角蛋白细胞特异性[3]

b、c：小鼠角质形成细胞（mKCs）；d、e：小鼠脂肪来源基质细胞（mASCs）

 

图5： K14 SCP3启动子在体内增强表皮特异性[3]

KRT14：角质形成细胞

 

三. 给药方式

在AAV基因治疗中，给药途径直接影响病毒的生物分布、最终转导效率和安全性。在皮肤组织基因治疗中，目前常见给药方式为皮内注射（Intracutaneous injection）和皮下注射（Subcutaneous injection）。皮内注射将病毒溶液直接注入表皮与真皮之间，这种方式能确保病毒在局部皮肤高浓度沉积，尤其适用于靶向真皮成纤维细胞、免疫细胞或血管，也是许多皮肤病模型（如疤痕、纤维化）的常用方法。可进行多点注射以覆盖更大面积。皮下注射将病毒注射到真皮下方、肌肉层之上的皮下组织层，适用于需要靶向皮下脂肪组织或实现病毒通过淋巴管或局部扩散缓慢进入真皮的情况。

 

皮内注射

• 实验前准备
  剃除注射部位毛发，用碘伏棉球或75%酒精棉球以画圈方式擦拭注射部位皮肤进行消毒。

 

• 皮内注射
  用非惯用手拇指和食指轻轻捏起并绷平注射部位的皮肤。使用1 mL胰岛素注射器，将针头斜面朝上，以与皮肤呈约30°的角度缓慢刺入皮内，缓慢匀速推注，注射时阻力应明显增大，并在注射部位形成一可见的、隆起的白色皮丘，皮丘的形成是注射成功的标志。注射完毕后留针片刻，然后沿原进针角度拔出针头。用干棉球轻压注射点片刻，切忌用力揉搓，以免药液渗出或损伤组织。

 

皮下注射
用非惯用手拇指和食指轻轻捏起皮肤，形成一个明显的皮肤皱褶。将注射器针头斜面朝上，以与皮肤呈30-45°的角度刺入所捏起皮肤皱褶的根部，刺入后针头较易摆动则说明已刺入皮下。缓慢匀速推注药液，注射时阻力应极小。注射完毕后留针片刻拔出，用干棉球轻压注射点数秒止血。

 

综上所述，针对皮肤组织不同靶细胞采用的注射方式、血清型及启动子推荐如表1所示，仅供参考。

表1：注射方式与剂量参考

 

表1：注射方式与剂量参考

细胞	血清型	注射方式	注射体积	病毒用量	启动子
表皮细胞、真皮细胞[1-3]	AAVDJ、AAV5	皮内注射	~20μL/site，多点注射	5E10-2E11vg/鼠	广谱启动子、K14
皮下组织[1, 3]		皮下注射	~100 μL	5E10-2E11vg/鼠	广谱启动子、K14

 

参考文献：

1. Keswani, S.G., et al., Pseudotyped adeno-associated viral vector tropism and transduction efficiencies in murine wound healing.Wound Repair Regen, 2012. 20(4): p. 592-600.
2. Kurita, M., et al., In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.Nature, 2018. 561(7722): p. 243-247.
3. Shen, Q., et al., Optimization of an adeno-associated viral vector for epidermal keratinocytes in vitro and in vivo.J Dermatol Sci, 2024. 115(3): p. 101-110.

 

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